---

НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ

Методи виявлення та визначення кількості
бактерій виду Escherichia coli

(ГОСТ 30726-2001, IDT)

ДСТУ ГОСТ 30726-2002

Видання офіційне

БЗ № 8 - 2002

Київ
ДЕРЖСТАНДАРТ УКРАЇНИ
2002

ПЕРЕДМОВА

1 ВНЕСЕНО Українським науково-дослідним інститутом стандартизації, сертифікації' та інформатики 2 НАДАНО ЧИННОСТІ наказом Держстандарту України від 24 липня 2002 р. № 462 з 2003-01-01 З СТАНДАРТ ВІДПОВІДАЄ ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и опреде­ления количества бактерий вида Escherichia coli (Продукта харчові. Методи виявлення та визна­чення кількості бактерій виду Escherichia coli)

Ступінь відповідності — ідентичний (IDT)

Цей стандарт видано на підставі «Угоди про проведення узгодженої політики у сфері стандарти­зації, метрології та сертифікації» від 12.03.1992 р.

4. ВВЕДЕНО ВПЕРШЕ

5. ОФОРМЛЕННЯ: А. Павленко

Право власності на цей документ належить державі.

Відтворення, тиражування та розповсюдження документа повністю чи частково
на будь-яких носіях без офіційного дозволу заборонено.

Стосовно регулювання прав власності звертатись до Держстандарту України

Держстандарт України, 2002

I

IНАЦІОНАЛЬНИЙ ВСТУП

Цей національний стандарт ідентичний міждержавному стандарту ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli (Продукти харчові. Методи виявлення та визначення кількості бактерій виду Escherichia coli).

Стандарт містить вимоги які відповідають чинному законодавству.

До стандарту внесено такі редакційні зміни:

1. на другій сторінці обкладинки вилучено інформацію щодо надання чинності цьому міждер­жавному стандарту в Російській Федерації (п. З Предисловия) та інформацію щодо заборони відтво­рення, тиражування і розповсюдження як офіційного видання на території Російської Федерації без дозволу Держстандарту Росії;

2. вилучено інформацію стосовно коду УДК, коду ОКП, групи згідно з КГС та вихідні дані організації-видавця Російської Федерації.

ГОСТ 30519-97/Р 50480-93 не прийнято як національний стандарт і чинний замість нього документ в Україні відсутній. Копію зазначеного документа можна отримати в Головному фонді нормативних документів.

IllГОСТ 30726-2001

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества
бактерий вида Escherichia coli

Издание официальное

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ
ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
Минск

Предисловие

1. РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овоще­сушильной промышленности (ВНИИКОП) и МТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей»

ВНЕСЕН Госстандартом России

2. ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 19 от 24 мая 2001 г.)

За принятие проголосовали:

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 2001Содержание

1. Область применения 1

2. Нормативные ссылки 1

3. Сущность методов 1

4. Отбор и подготовка проб 2

5. Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы) 2

6. Подготовка к анализу 2

7. Проведение анализа 3

8. Обработка результатов анализа 5

Приложение А Основные дифференцирующие признаки видов рода Escherichia 6МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli

Food-stuffs. Methods for detection and determination of Escherichia coli

Дата введения 2002—07—01 Дата введения в Украине 2003-01-01

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта бактерий вида Excherichia coli (E.coli) и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.

Выбор метода определения количества E.coli зависит от предполагаемой обсемененности продукта бактериями семейства Enterobacteriaceae и осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 30518.

2. Нормативные ссылки

8. настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9284—75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1—84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104—88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 26668—85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологичес­ких анализов

ГОСТ 26669—85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670—91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 29184—91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae

ГОСТ 30425—97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ 30518—97/Р 50474—93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количе­ства бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)

ГОСТ 30519—97/Р 50480—93 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

3. Сущность методов

Методы выявления и определения НВЧ E.Coli основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубиро­вании посевов, учете положительных колб (пробирок), пересеве культуральной жидкости на поверх­ность агаризованной селективно-диагностической среды для дальнейшего подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к E.coli.

Издание официальное

Методы определения количества E.coli посевом в или на агаризованные селективно-диагнос­тические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных для E.coli колоний, подтверждении по биохимическим и культуральным признакам роста принад­лежности выделенных колоний к E.coli.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб — по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

3. Аппаратура, материалы, реактивы (в т.ч. индикаторы)

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и допустимой погрешностью ±10 мг (для взвешивания продукта) и весы с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

микроскоп биологический с приспособлением для фазово-контрастного микроскопирования, обеспечивающий увеличение 900—1000^х;

петлю бактериологическую;

поплавки (трубки Дархема);

стекла предметные по ГОСТ 9284;

термостаты с диапазоном рабочих температур 28—55 °С, позволяющие поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С;

бриллиантовый зеленый;

генцианвиолет;

желчь говяжью сухую или натуральную;

магний сернокислый;

метиловый красный;

метиловый фиолетовый;

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный;

сорбит,

феноловый красный;

целлобиоза.

3. Подготовка к анализу

   1. Приготовление растворов реактивов

      1. Реактив Кларка: 0,1 г метилового красного растворяют в 300 см³ этилового спирта и добавляют 200 см³ дистиллированной воды. Реактив хранят в посуде из темного стекла не более 1 мес при температуре (4±2) °С.

      2. Реактивы Ковача и Эрлиха готовят по ГОСТ 30519.

      3. Спиртовой раствор а-нафтола готовят по ГОСТ 30519.

      4. 1.4 Приготовление индикаторных бумажек для обнаружения индола: 3—5 г парадиметилами­нобензальдегида, 10 см³ концентрированной фосфорной кислоты и 50 см³ этилового спирта тща­тельно перемешивают в фарфоровой ступке. В полученном растворе смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками шириной около 1 см. Цвет полученных бумажек — желтый. Индикаторные бумажки хранят не более 1 мес в темном месте.

      5. Раствор гидроокиси калия массовой концентрации 400 г/дм³: 40 г гидроокиси калия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

      6. Реактивы и растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

   2. Приготовление питательных сред

      1. Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 30518.

      2. Бульон Мак-Конки готовят по ГОСТ 30518.

      3. Бульон глюкозо-фосфатный, сухой промышленного производства.

      4. Бульон мясо-пептонный с триптофаном: 0,05 г L-триптофана растворяют в 100 см³ мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6—7 см³ и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

      5. Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1.

      6. Среду Кесслер готовят по ГОСТ 30518.

      7. Среда Кларка: в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворяют 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, охлаждают до 45—55 °С и устанавли­вают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (7,2±0,1). Среду разливают по 5—6 см³ в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд.

      8. Среда (типа Клиглера) для первичной дифференциации энтеробактерий, сухая промыш­ленного производства.

      9. Среда Козера: в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворяют 1,5 г фосфор­нокислого двузамещенного натрия-аммония, 1,0 г фосфорнокислого однозамещенного калия, 0,2 г сернокислого магния и 2,5 г лимоннокислого натрия, охлаждают до 45—55 °С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,1) при 25 °С. Среду стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

После стерилизации к 1 дм³ среды добавляют 10 см³ спиртового раствора бромтимолового синего массовой концентрации 5 г/дм³, затем среду разливают по 6—7 см³ в стерильные пробирки. Приготовленная среда имеет оливково-зеленый цвет.

Цитратный агар Симмонса выпускается промышленностью в сухом виде.

Допускается сухую среду Гисса с углеводами готовить на основе сухого питательного агара: к 7,3 г сухого питательного агара прибавляют 3,65 г соответствующего углевода (глюкозы, лактозы, целлобиозы или сорбита), 0,38 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 3,65 г натрия хлорис­того, 0,02 г бромкрезолового пурпурового. Смесь тщательно перемешивают в фарфоровой ступке и хранят герметично закрытой в темном месте. Полученные 15 г порошка рассчитаны на приготов­ление 1 дм³ среды. При приготовлении среды порошок тщательно размешивают в дистиллированной воде, кипятят 1—2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают по 5—6 см³ в пробирки и стерилизуют при температуре (110±1) °С в течение 20 мин или дробным методом — текучим паром по 30 мин три дня подряд. Приготовленная среда имеет фиолетовый цвет.

3. 12. Среда Эндо, сухая промышленного производства.

   13. Трехсахарный агар готовят по ГОСТ 30519.

   14. Среды из сухих препаратов промышленного производства готовят по прописям, указан­ным на этикетках.

   15. Тест-системы для биохимической идентификации промышленного производства.

4. Проведение анализа

   1. Посевы для определения количества Е.соїі в 1 г (см³) продукта и выявления E.coli в определенной навеске продукта проводят по ГОСТ 30518.

Посевы на агаризованной и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24—48 ч. Чашки Петри инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидких средах, а окончательный учет проводят через (48+3) ч.

Положительными считают посевы в жидкие среды, в которых имеет место рост микроорганиз­мов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть изменении цвета среды).