Страница 2: Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів. Методичні вказівки (45173)

Доцільно половину проби стічної води використати для концентрування в ній вірусу, а другу половину зберігати як резерв при температурі +4 град. С до успішного завершення етапів концентрування та індикації вірусу.

4.2. Обробка води поверхневих та підземних водойм

Проби води, відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або у холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім верхній шар води в об'ємі відливають і використовують для подальшого дослідження.

4.3. Обробка питної води

Проби питної води в об'ємі , відібрані в стерильний посуд і доставлені в лабораторію, поміщають у холодильник або холодну кімнату при температурі +4 град. С, дають відстоятися впродовж 30 хв. у доставленому посуді, а потім вдаються до дехлорування (див. Розділ 3.3).

Проби води, звільнені від хлору, використовують для подальшого дослідження.

5. Методи концентрації вірусів у пробах води

Методи, що застосовують для концентрації вірусів у пробах води, повинні відповідати таким вимогам: можливість концентрувати малу або навіть незначну кількість патогенних для людини вірусів, наявних у великих об'ємах води; забезпечувати відокремлення вірусів від бактерій та інших контамінантів; сконцентрований вірусний матеріал має зберігати життєздатність для подальшого вірусологічного дослідження.

Методи концентрації вірусів з води можна умовно поділити на групи:

- фізичні (ультрацентрифугування, фільтрація, ультрафільтрація, пінна флотація, електрофорез та електроосмос);

- фізико-хімічні (осадження за допомогою сульфату амонія, сульфату алюмінія, концентрація поліетиленгліколем, двохфазний метод із застосуванням ПЕГ 6000 та декстрану Т40 Amersham-Pharmacia та ін.);

- адсорбційні (адсорбція на марлевих тампонах, активованому вугіллі, природних мінеральних сорбентах - бентоніті, асканіті та ін., на іоно-обмінних смолах, аміноетоксиаеросилі, поліметилксилоксані, макро-пористому склі, двохфазний метод та ін.).

Вибір методу концентрації вірусів у пробах води залежить від багатьох чинників: ступеня забруднення води, чутливості методики, доступності стандартизованого адсорбенту, наявності відповідного обладнання (наприклад, ультрацентрифуг з охолодженням або спеціального обладнання для ультрафільтрації) та навантаження на лабораторію.

Санітарно-вірусологічний моніторинг за забрудненням води (стічної, поверхневих та підземних водойм, питної), як правило, в практичних лабораторіях проводиться за кількома показниками (ентеровіруси, ротавіруси, аденовіруси, віруси гепатиту А, коліфаги), тому доцільно використовувати такий спосіб концентрації і використовувати єдиний реактив для концентрації, який би дозволяв визначати декілька показників вірусів одномоментно.

Усі роботи, пов'язані з концентрацією та виділенням вірусів, здійснюються за умови дотримання правил безпеки (при роботі зі збудниками III-IV групи патогенності) у повній відповідності до регламентуючих документів (див. Список використаних джерел).

5.1. Концентрація вірусів методом фільтрації через фільтр з матеріалу Петрянова

Фільтр з матеріалу Петрянова (далі ФП) фіксують у будь-якому утримувачі фільтру, прикладаючи до решітки тою чи іншою його стороною, оскільки обидві поверхні фільтру ідентичні. Діаметр ФП може дорівнювати 3-.

Досліджувану пробу води, що попередньо пройшла обробку (див. Розділ 4), пропускають під тиском через фільтрувальну установку або спеціальну насадку з утримувачем фільтру. Після проходження всієї досліджуваної проби води через фільтр та адсорбції на ньому вірусів його видаляють стерильним пінцетом із утримувача і вміщують у стерильну чашку Петрі.

Для елюції вірусу з поверхні фільтру на нього наносять розчин NaCl (елюент) з розрахунку 2,0 мл на 10 кв.см поверхні фільтра, тобто 2 мл рідини на фільтр діаметром . Фільтр промивають, піпетуючи рідину впродовж 2-3 хв., а далі рідину зливають у флакон і отримують елюат I. Процедуру елюції вірусів з фільтру повторюють, елюати I і II об'єднують.

Недоліком методу є швидке засмічення пор фільтру та неповна десорбція вірусу з його поверхні.

5.2. Концентрація вірусів методом осадження за допомогою алюмінія сульфату

    Температуру попередньо  обробленої  проби  води  доводять  до

+20 +- 1 град.  С на водяній  бані  чи  за  допомогою  термостату.

До 1   л   води   додають  2  мл  10%  розчину  алюмінія  сульфату

(Al (SO ) ),  ретельно перемішують, рН води краплинами доводять до

  2   4 3

значень  5,4-5,8.  Для  цього  застосовують розчин HCl або

розчин NaOH.

Досліджувану пробу (рН 5,4-5,8) із внесеним в неї розчином алюмінія сульфату витримують при температурі +18-20 град. С впродовж 4 годин, або при температурі +4 град. С - впродовж 18 годин. Прозорий надосад обережно зливають та викидають, а білий аморфний осад, що містить у собі віруси, переносять у центрифужну склянку або пробірку і центрифугують при 2000 об./хв. впродовж 10-15 хв. Надосад знову видаляють, а осад, що став більш щільним, суспендують у 4,0 мл розчину Хенкса (рН 7,4) для елюції вірусів і знову центрифугують за вказаних вище умов. Для подальшого дослідження відбирають вже надосад (елюат), в якому міститься сконцентровані віруси, а осад алюмінія сульфату, звільнений від вірусу, викидають.

В якості елюентів, окрім розчину Хенксу (рН 7,4), можна використовувати фосфатний буфер (рН 8,2) та ін.

Проби води, оброблені солями алюмінію, зберігають тільки при температурі +4 град., ні в якому разі не заморожуючи їх.

5.3. Концентрація вірусів за допомогою гідрогелю метилкремнієвої кислоти

Дослідження починають з підготовки гідрогелю метилкремнієвої кислоти (далі ГГМКК), що випускається вітчизняним виробником ЗАТ "Екологоохоронна фірма "КРЕОМА-ФАРМ", м. Київ, N Р/П Р.11.02/05576.

В основі методу лежить принцип фізичної адсорбції кремнійорганічною матрицею ПМС рота-, ентеро-, кишкових аденовірусів людини, ВГА з проб води. Пориста структура ГГМКК характеризується стабільним складом, питомою сорбційною поверхнею 100-150 кв.м/г, сумарним об'ємом пор 2,7-3,0 см/г, радіусом пор понад 100 нм, високою ефективністю адсорбції ротавірусів (70-75 нм), ентеровірусів (28-30 нм), ВГА (27-30 нм), аденовірусів 40 та 41 типів (80-90 нм). Використовують дрібнодисперсну форму ГГМКК.

ГГМКК попередньо розфасовують по та по для зручності використання.

ГГМКК у пробу води додають з розрахунку на .

Концентрація вірусів у пробах стічної води: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами розчин HCl.

До освітленої та підкисленої проби стічної води додають Ентеросгелю, ретельно та енергійно струшують вручну (4-5 хв.) або струшують автоматично впродовж 10-20 хв.

Проби води із внесеним Ентеросгелем розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони (зручно використовувати флакони з-під поживних середовищ для культури клітин або з-під трипсину для культур клітин об'ємом 250 мл чи 500 мл) та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. або відстоюють 14-16 годин. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону не тільки осад, а ще й надосад (загальний об'єм 20 мл). Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за вказаних вище умов. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", у кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГМКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (загальний об'єм 4 мл), і використовують для подальшого дослідження.

В якості елюентів, окрім трис-буферу з рН 8,4, можна використовувати фосфатний буфер, рН 8,4.

Процес концентрації вірусів з проб займає загалом не більше 1,5-2,0 годин.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах стічної води надана у табл. 6.1.

Таблиця 6.1.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі стічної води

Концентрація вірусів у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм: досліджувані проби води доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води від'юстовують до значення 5,0, додаючи краплинами розчин HCl.

До досліджуваної проби додають ГГМКК. При роботі з води відповідно вносять ГГМКК.

Проби води із внесеним ГГМКК розливають у стерильні центрифужні склянки або скляні флакони на 500 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився, є дуже легким, не щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні склянки або флакону осад. Загальний об'єм осаду має не перевищувати 20 мл! Осад струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірки, а надосад легко видаляють і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають 2,0 мл трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок Ентеросгелю, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.

Схема концентрації вірусів Ентеросгелем у пробах води поверхневих (відкритих) або підземних водойм надана у табл. 6.2.

Таблиця 6.2.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі води поверхневих (відкритих) та підземних водойм

Концентрація вірусів у пробах питної води: проби води попередньо звільняють від хлору, доводять до температури 20 +- 1 град. С, рН води і доводять до значення 5,0, додаючи краплинами розчин HCl.

До проби водопровідної води/питної води об'ємом 10- додають відповідно 20- ГГМКК, який вносять безпосередньо у скляний посуд.

Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!

Для ефективної адсорбції вірусів Ентеросгелем, пробу струшують вручну або автоматично. Утворений комплекс "вірус-ГГМКК" осаджують шляхом відстоювання при температурі +4 град. С впродовж 14-18 годин. Так, наприклад, якщо проби води доставлені до лабораторії у другій половині або наприкінці робочого дня, то після вказаної вище підготовки та обробки ГГМКК вони можуть бути залишені для седиментації осаду до ранку при кімнатній температурі 20 +- 1 град. С. Далі надосад обережно зливають через край, залишаючи на дні скляного посуду 200 мл нещільного білого осаду. Цей залишок (осад + невелика кількість надосаду) струшують і переносять у центрифужні стакани або флакони на 250 мл та центрифугують при 1000 об./хв. впродовж 10-20 хв. Білий осад, який утворився після центрифугування, є ще також ще не досить щільним, тому надосадову рідину обережно зливають через край, залишаючи на дні флакону близько 20 мл. Цей залишок струшують і переносять в дві центрифужні пробірки та повторно центрифугують за тим самим режимом. Після повторного центрифугування осад щільно формується на дні пробірок, а надосад легко видаляють пастерівською піпеткою або дозатором і в роботі більше не використовують.

До отриманого осаду, що являє собою осаджений комплекс "вірус-ГГМКК", в кожну центрифужну пробірку додають по 2,0 мл трис-буферу з рН 8,4 для елюції вірусу з часточок ГГММКК, легко струшують вручну та залишають при кімнатній температурі на 4-5 хв. Потім центрифугують при 2000-3000 об./хв. впродовж 20 хв. Відбирають у стерильні пробірки надосад (елюат), що є концентратом вірусів (4 мл), і використовують для подальшого дослідження.