Для нейтралізації можна використовувати й інший спосіб: до 100 см3 відпрацьованого буфера додати 100 мг порошку активованого вугілля, залишити розчин на 1 годину при кімнатній температурі, періодично помішуючи, після чого профільтрувати рідину. Фільтрат може бути злитий у каналізацію, а фільтр з вугіллям слід запакувати у пластиковий пакет і помістити у контейнер для захоронення на полігоні токсичних відходів.
7.7. Обробку автоматичних дозаторів здійснюють двічі на рік (при необхідності частіше). Автоматичні дозатори в лабораторіях, які працюють з матеріалом, підозрілим на вміст збудників I - II груп патогенності розбирають, обробляють мийним розчином для видалення жирового забруднення, після чого залишки мийного засобу видаляють серветкою, змоченою водою. Потім проводять обробку 1 N соляною кислотою (час експозиції - 1 година). Залишки розчину ретельно видаляють серветкою, змоченою водою, і проводять знезараження вологих поверхонь ультрафіолетовим промінням упродовж 1 години. Після закінчення обробки дозатори збирають і проводять калібрування відповідно до інструкції виробника з експлуатації відповідного приладу.
В інших випадках обробку автоматичних дозаторів проводять згідно з інструкцією виробника, користуючись для деконтамінації 70 % етанолом, або спеціальними розчинами для деконтамінації, рекомендованими в інструкціях з експлуатації приладу.
Дозатори, які можна автоклавувати (бажано використовувати саме такі), знезаражують паром під тиском 0,2 МПа при температурі (132 + 2)° C протягом 60 хвилин.
8. Правила роботи в боксах біологічної безпеки при виділенні НК
8.1. Для запуску в роботу нового боксу біологічної безпеки всі його поверхні необхідно вимити мийним засобом, потім ретельно змити чистою водою, обробити розчином дезінфектанту (витримати експозицію відповідно до нормативного документу на конкретний дезінфекційний засіб), знову змити стерильною водою, обробити 70 % етанолом і піддати ультрафіолетовому опроміненню.
8.2. Перед початком роботи боксу для знезараження повітря у ньому його включають і залишають працювати впродовж 1 години в режимі максимальної фільтрації.
8.3. Кожний бокс укомплектовують набором необхідного для роботи обладнання, ємкістю для лабораторних відходів, розчином 70 % етанолу та робочим розчином дезінфектанту.
8.4. Кількість апаратури та матеріалів у боксі повинна бути мінімальною.
8.5. Перед початком роботи всі робочі поверхні протирають 70 % етанолом. Окремо обробляють етанолом дозатори, вортекс, термостат, центрифугу (особливо ретельно ті місця, до яких найчастіше в процесі роботи торкаються руками або ємкостями з клінічним матеріалом).
Категорично заборонено проводити обробку робочих поверхонь однією серветкою.
8.6. Під час роботи слід максимально обмежити рух персоналу за спиною спеціаліста, що працює в боксі безпеки.
Працівнику, що працює в боксі, не слід порушувати повітряний потік неодноразово виймаючи і знову вводячи руки в бокс. Рухи повинні бути плавними і перпендикулярними площині відкритої передньої частини. Маніпуляції з матеріалом починають тільки через хвилину після того, як руки просунуті в середину боксу, для того, щоб порушений потік повітря заспокоївся і почав обтікати руки.
Усі роботи повинні проводитися на середній або задній частині "столішниці" боксу і бути видимими через оглядову панель.
Жодна решітка не повинна блокуватися записами, піпетками або іншими матеріалами, оскільки це порушує повітряний потік і може викликати контамінацію матеріалу та оператора.
Документи не слід поміщати усередину боксу безпеки.
8.7. Під час проведення маніпуляцій на вортексі та в мікроцентрифузі штативи для наконечників, флакони та пробірки повинні бути закритими.
8.8. При протіканні пробірки з клінічним матеріалом у процесі роботи слід перенести вміст у чисту пробірку, а непотрібну пробірку скинути в окрему ємкість для інфікованого матеріалу.
8.9. У кінці роботи одягають нові одноразові рукавички і проводять обробку 70 % етанолом усіх робочих поверхонь, як і перед початком роботи.
8.10. Після завершення робочої зміни ємкість з відпрацьованими наконечниками звільняють. Усі предмети всередині боксу, уключаючи обладнання, повинні бути деконтаміновані. Обробку проводять робочим розчином дезінфектанту з відповідною експозицією, після чого протирають одноразовими серветками, змоченими стерильною водою для зняття залишків дезінфекційного засобу.
8.10.1. Через наконечник відсмоктувача в кінці роботи пропускають дезінфекційний розчин, шланг відсмоктувача зовні обробляють серветкою, змоченою у дезінфекційному розчині.
8.10.2. Вимикають усі електричні прилади в боксі та відсмоктувач.
8.10.3. Протирають 70 % етанолом ручки боксу та вимикачі панелі управління боксу. Закривають бокс і вмикають ультрафіолетове опромінення на 1 годину.
9. Профілактика контамінації та порядок дій при виникненні контамінації ПЛР-лабораторії НК
9.1. Висока чутливість методу ПЛР зумовлює його найбільшу проблему - можливість отримання хибнопозитивних результатів унаслідок потрапляння із зовнішнього середовища в реакційну суміш молекул НК або її фрагментів, здатних бути матрицями в реакції ампліфікації. Джерелом хибних результатів можуть бути перехресна контамінація між пробами в процесі отримання НК або при постановці ПЛР, забруднення досліджуваних зразків позитивними контролями, але найчастіше - є контамінація продуктами ампліфікації попередніх досліджень.
Навіть поодинокі молекули ДНК можуть бути багато разів копійовані в процесі ПЛР, приводячи до утворення цільового ДНК-продукту, а отже, до хибнопозитивного результату.
Хоча більшість причин хибнопозитивних результатів є наслідком внутрішньолабораторної контамінації, не варто скидати з рахунку і забруднення, що відбуваються поза лабораторією під час збору зразків, їх первинної обробки (фасування, пакування, транспортування), оскільки саме на цих стадіях найскладніше забезпечити стерильні умови роботи.
9.2. Існує декілька способів профілактики внутрішньолабораторної контамінації. Для мінімізації ризику отримання хибних результатів необхідно, насамперед, територіально розмежувати різні стадії аналізу, тобто правильно спланувати розміщення лабораторії. Крім того, розроблено метод з використанням урацил-ДНК-глікозилази (далі - УДГ). Цей фермент здатний вищеплювати з ДНК урацил. З цією метою до суміші трифосфатів додають урацил, який в процесі ПЛР вбудовується в ампліфіковану ДНК і служить мішенню для УДГ. Якщо амплікони від попередньої реакції потраплять у щойно приготовану суміш, що містить УДГ, у них буде вищеплено урацил і подальше прогрівання до 95° C призведе до деградації ампліконів. УДГ є активною при температурі 20 - 50° C, тому вона не руйнує амплікони під час ПЛР, але вимагає ретельного підбору концентрації фермента і негайного проведення електрофорезу або ГІФА після закінчення ампліфікації.
9.3. Використання методики постановки ПЛР без етапу детекції, коли необхідно відкривати пробірки, дозволить уникнути ризику розповсюдження ампліконів у зовнішньому середовищі. Існують тест-системи з флуоресцентною детекцією. У цьому випадку використовуються гібридизаційні олігонуклеотидні зонди, мічені флуорофорами, і реєструється флуоресценція, яка з'являється тільки при наявності специфічного продукту.
9.4. При виникненні контамінації (отримання повторних позитивних результатів у негативних контролях, а також при тестуванні контрольних змивів) у лабораторії проводять комплекс заходів, обсяг яких визначається результатами дослідження контрольних змивів. Комплекс заходів включає:
- утилізацію усіх реактивів, що перебувають у "контамінованій" зоні;
- утилізацію досліджуваних матеріалів на всіх проміжних стадіях обробки (крім вихідної);
- генеральне прибирання, хімічну і ультрафіолетову дезінфекцію усіх поверхонь лабораторних приміщень;
- дезінфекцію меблів, робочих поверхонь, а також поверхонь корпусів приладів і обладнання хімічним методом і ультрафіолетовим опроміненням;
- обробку парою під тиском усього спецодягу "контамінованої" зони.
9.5. Випадки контамінації ПЛР-лабораторії реєструють у спеціальному журналі з вказівкою заходів щодо її усунення і результатів внутрішньолабораторного контролю якості та ефективності проведених заходів.
9.6. Проведення ПЛР-досліджень до завершення деконтамінаційних заходів і отримання негативних результатів внутрішньолабораторного контролю не допускається.
9.7. Порядок дій персоналу при контамінації ПЛР-лабораторії НК наведений нижче.
9.7.1. Співробітників, які проводять деконтамінаційні заходи, забезпечують одноразовими халатами, шапочками, бахілами і рукавичками, одноразовими ганчірками, ємкостями для приготування необхідних кількостей мийних і дезінфекційних розчинів.
9.7.2. Кожну зону ПЛР-лабораторії обробляють працівники, які в ній працюють.
9.7.3. Для обробки кожної зони використовують новий набір інвентарю для прибирання.
9.7.4. Кожну зону ПЛР-лабораторії розбивають на ділянки прибирання, наприклад:
ділянка 1 - бокс біологічної безпеки і обладнання всередині нього;
ділянка 2 - зовнішні поверхні боксу біологічної безпеки;
ділянка 3 - шафи для витратних матеріалів;
ділянка 4 - холодильники для зберігання реактивів, зразків (проб);
ділянка 5 - обладнання, яке використовують у роботі, але яке розташоване поза боксом біологічної безпеки;
ділянка 6 - поверхні приміщення (стіни, вікна, батареї, стеля, двері тощо);
ділянка 7 - підлога.
9.7.5. Перед початком обробки персонал одягає одноразовий одяг, бахіли, шапочки, рукавички; готує мийні і дезінфекційні розчини. Обробку проводять послідовно пересуваючись від однієї ділянки до іншої. Кожну ділянку обробляють окремими ганчірками.
9.7.6. Поверхні кожної ділянки на початку обробляють мийним розчином для видалення жирових забруднень, після чого залишки мийного засобу видаляють ганчірками, змоченими водою.
9.7.7. Потім на поверхню наносять на 30 хвилин дезінфекційний розчин (наприклад, 0,2 % розчин "Жавель-Клейду" або аналогічні йому, дозволені до застосування з цією метою в установленому порядку).
Залишки дезінфекційного засобу ретельно видаляють серветками, змоченими водою.
9.7.8. Після завершення вказаної обробки проводять знезараження ультрафіолетовими променями вологих поверхонь протягом 1 години.
Заходи, описані в підпунктах 9.7.7 та 9.7.8 пункту 9.7 цих Правил, повторюють ще раз.
9.7.9. Кожний подальший етап обробки проводять у новому одноразовому одязі (халат, шапочка, бахіли, рукавички) з використанням нових ганчірок. Для видалення залишків дезінфекційних засобів, нанесених на поверхню, ганчірки ретельно прополіскують у чистій воді, оброблювану поверхню протирають кілька разів. Після кожного етапу обробки ганчірки слід утилізувати.
9.7.10. Після завершення деконтамінації беруть повторні змиви, які досліджують на наявність НК збудників інфекційних захворювань, діагностику яких найчастіше здійснювали в цій лабораторії, а також на виявлення НК збудників, що мають короткі (менше 300 пар нуклеотидів) специфічні продукти ампліфікації (довжина специфічного фрагмента вказана в інструкціях до тест-систем).
9.7.11. У разі отримання в зразках змивів позитивних результатів ПЛР-аналізу обробку повністю повторюють.
9.7.12. Забруднений витратний матеріал (пробірки, наконечники тощо) утилізують.
10. Контроль якості досліджень і оцінка роботи ПЛР-лабораторії
10.1. Контроль якості досліджень є невід'ємною складовою правильної організації роботи ПЛР-лабораторії. Він включає в себе постійне проведення внутрішньолабораторного контролю якості, передбаченого системою забезпечення якості досліджень, що діє в кожній конкретній лабораторії, і участь в програмах зовнішньої оцінки якості ПЛР-досліджень (професійне тестування).
10.2. Система забезпечення якості роботи ПЛР-лабораторії повинна передбачати систематичне проведення внутрішньолабораторного контролю якості дезінфекції (деконтамінації).
10.3. Періодичність проведення внутрішньолабораторного контролю якості деконтамінації об'єктів довкілля визначається керівником лабораторії залежно від об'єму виконуваної роботи, але не рідше одного разу на квартал. У разі підозри на контамінацію внутрішньолабораторний контроль деконтамінації об'єктів довкілля лабораторії проводять негайно.
10.4. Для оцінки якості деконтамінаційних заходів та виявлення можливої контамінації лабораторії НК або продуктами ампліфікації контроль проводять шляхом відбору змивів з поверхонь. Змиви з поверхонь беруть стерильними ватними тампонами (мінімальний розмір площі 10 х ). Перед відбором змивів тампони змочують стерильним фізіологічним розчином або ТЕ-буфером ( Tris, ЕДТА), після чого обертальними рухами протирають робочі поверхні обладнання, меблів, дверних ручок, телефонів тощо. Особливу увагу приділяють приміщенням, які відвідують усі співробітники лабораторії (кімнати прийому їжі, туалет тощо). Після відбору змиву тампон поміщають у мікропробірки типу "епендорф" з 300 - 400 мкл ТЕ-буфера, обертальними рухами змивають відібраний матеріал протягом 10 - 15 секунд, уникаючи розбризкування розчину, і, відтиснувши надлишок рідини з тампону об стінки пробірки, видаляють.
Одержані суспензії центрифугують при (12000 об/хв) протягом 1 хвилини. Надосадову рідину відбирають наконечником з аерозольним бар'єром в мікропробірку об'ємом 1,5 мл. Для виділення НК використовують 0,1 - 0,2 мл надосадової фракції.
10.5. Для дослідження слід обирати тест-системи з внутрішнім контрольним зразком. Постановка негативних контролів при виділенні НК і проведенні реакції обов'язкова. Це дозволить своєчасно виявити контамінацію в лабораторії.
10.6. Керівник ПЛР-лабораторії або фахівець, на якого покладені функції контролю якості (менеджер з якості), періодично проводить тестування працівників шляхом надання контрольних задач (внутрішній контроль якості досліджень).
