---

Оксидазний тест призначається для диференціації бактерій

родини Enterobacteriaceae від родини Vibrionaceae, грамнегативних

бактерій родини Pseudomonadaceae та інших сапрофітних бактерій,

які мають активний фермент оксидазу та окислюють фенілендіамінові

сполуки до індофенолу яскраво синього кольору.

Використовують готові індикаторні системи промислового

виготовлення (системи індикаторні паперові (СІП-оксидаза), диски

оксидази виробництва PLIVA-LACHEMA, bioMerieux) чи папірці,

попередньо виготовлені за таким прописом:

30 мг альфа-нафтолу розчиняють у 2,5 куб.см 96%-ого етилового

спирту, додають 7,5 куб.см дистильованої води з 50 мг

фенілендіамінової сполуки. В отриманому розчині змочують

фільтрувальні папірці, висушують і зберігають у темному місці в

чорному папері не більше 6 місяців.

Використовують також таку методику:

реактив N 1. 1%-ий спиртовий розчин альфа-нафтолу.

реактив N 2. 1%-ий водний розчин фенілендіамінової сполуки.

Розчини зберігають у темних флаконах з притертими пробками:

N 1 - до одного місяця, N 2 - один тиждень. Перед застосуванням до

трьох частин розчину N 1 додають сім частин розчину N 2.

З кожною новою партією реактивів, а також періодично в

процесі зберігання реактивів чи готових препаратів проводять

контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які

дають позитивну реакцію (Pseudomonas fluorescens) і негативну

реакцію (E. coli) .

Надійний результат оксидазного тесту може бути отриманий лише

при використанні добової культури, вирощеної на неселективному

поживному агарі.

Увага! Для постановки тесту використовують скляну паличку або

платинову петлю.

5.7.12. Постановка оксидазного тесту

З ізольованої колонії кожного типу, які виросли на секторах

середовища Ендо, знімають частину колонії платиновою петлею або

скляною паличкою і наносять штрихом на фільтрувальний папір,

змочений реактивом. Якщо в місці нанесення бактеріальної маси

папір не змінює кольору, - оксидазний тест негативний, якщо папір

синіє протягом 1 хвилини, значить бактерії мають активну оксидазу.

Дослідження ізольованих колоній є обов'язковим, інакше можна

безпідставно відкинути належність досліджуваної колонії до

кишкових паличок у разі посиніння за рахунок домішок

оксидазопозитивних бактерій. При негативному оксидазному тесті

залишок колонії при потребі пересівають на напіврідке середовище з

лактозою.

5.7.13. Реактиви для фарбування за Грамом

Розчин генціану фіолетового: 1 г генціану фіолетового

розчиняють у 10 куб.см ректифікованого етилового спирту і додають

100 куб.см дистильованої води.

Розчин Люголя: 1 г йоду кристалічного, йодистого калію

розчиняють в 300 куб.см дистильованої води. Зберігають у флаконі з

темного скла.

Фуксин Ціля: основного фуксину розчиняють у 10 куб.см

спирту етилового ректифікованого і додають 100 куб.см

дистильованої води.

5.7.14. Фарбування за Грамом

Мазок на предметному склі фіксують трьохкратним проведенням

через полум'я пальника. На препарат накладають смужку

фільтрувального паперу і на нього наливають розчин генціану

фіолетового на 0,5-1,0 хвилини. Потім знімають папір, наливають

розчин Люголя на 0,5-1,0 хвилини, змивають розчин Люголя. Скло

прополіскують в етиловому спирті протягом хвилини, поки не

перестане відходити фарба. Після чого скло ретельно промивають

водою та забарвлюють протягом 1-2 хвилин фуксином Ціля, розведеним

1:10 дистильованою водою. Після промивання і підсушування

препарату мазок розглядають під мікроскопом.

Під час використання набору для фарбування за Грамом

промислового виробництва користуються інструкцією до набору.

5.8. Визначення загальної кількості мезофільних аеробних і

факультативно-анаеробних мікроорганізмів (МАФАМ).

5.8.1. Принцип методу

Визначення МАФАМ проводять методом глибинного посіву

відповідної наважки паперу (картону) у поживний агар з урахуванням

усіх колоній мікроорганізмів, які можна побачити при 2-5-кратному

збільшенні, що виросли за температури 30 +- 1 град. С протягом

72 +- 2 годин у глибині та на поверхні поживного агару.

5.8.2. Приготування проб для посіву і проведення аналізу

Випробування повинні проводити висококваліфіковані

спеціалісти.

Із зразків, відібраних згідно з пунктом 5.1, готують наважку

із середнього шару зразків масою 2,0 +- . Зразки нарізають

дрібними квадратами, поміщають у стерильну ємність для

дезінтегрування, у якій міститься 200 куб.см стерильного

фосфатного буфера згідно з пунктом 5.7.1 (розведення 1:100) і

проводять розщеплення волокон до отримання однорідної суспензії

(повна дезінтеграція).

Після відстоювання проби стерильною піпеткою місткістю 1,0

куб.см набирають 1,0 куб.см рідини і переносять у пробірку, яка

вміщує 9,0 куб.см стерильного фізіологічного розчину і перемішують

(розведення 1:1000).

У залежності від очікуваного обсіменіння зразка аналогічно

готують такі розведення.

Поживний 1,5%-ий агар розтоплюють на водяній бані і

охолоджують до температури 45 +- 5 град. С. Стерильні чашки Петрі

підписують і розташовують на суворо горизонтальній поверхні столу.

З двох відповідних розведень кожної проби роблять посів 1,0 куб.см

у три паралельні чашки.

Після внесення проби в чашки Петрі в кожну з них заливають

10-12 куб.см охолодженого поживного агару і, обережно обертаючи на

поверхні столу, перемішують уміст чашки, щоб досягти рівномірного

розподілу волокон у культуральному середовищі. При цьому треба

запобігати утворенню бульбашок повітря, неповному заповненню дна

чашки агаром, попаданню середовища на краї та кришку чашки. Чашки

залишають на горизонтальній поверхні до застигання середовища,

потім перевертають догори дном і ставлять у термостат.

Посіви вирощують за температури 30 +- 1 град. С протягом

72 +- 2 годин. Чашки з посівами розташовують у термостаті таким

чином, щоб відстань між чашками та стінками термостата була не

менше .

Колонії, які виросли як на поверхні, так і в товщі агару,

підраховують за допомогою пристрою для підрахунку колоній.

Ураховують усі колонії, що виросли, але на чашці повинно бути не

більше 300 колоній.

Підраховують кількість колоній мікроорганізмів у кожному з

паралельних посівів одного розведення. За результатами визначають

середньоарифметичне значення числа колоній в посівах одного

розведення. При підрахунку враховують кратність розведення проб.

Результат виражають у колонієутворювальних одиницях в

досліджуваної проби і заносять до протоколу.

Результат видають на основі підрахунку колоній на одній

чашці, якщо інший підрахунок неможливий (при повзучому рості

бактерій, який покриває всю поверхню чашки). Якщо на всіх чашках

має місце ріст розпливчастих колоній, який не розповсюджується на

всю поверхню чашки, чи виросло більше 300 колоній і аналіз не

можна повторити, підраховують на секторі чашки з подальшим

перерахунком на всю поверхню. У таких випадках у протоколі

відмічають "число КУО в 1 куб.см - орієнтовно". Якщо підрахунок

колоній на чашках неможливий, то в протоколі відмічають "зливний

ріст".

Якщо результат у межах чисел від 1 до 100, то записують

отримане число. Якщо результат у межах чисел від 101 до 1000, то

результат закруглюють до десятків. Якщо результат у межах чисел

від 1001 до 10000, то результат заокруглюють до сотень і т.ін.

5.9. Визначення лактозопозитивних кишкових паличок -

загальних коліформ

5.9.1. Визначення поняття показника

До лактозопозитивних кишкових бактерій (далі - ЛКБ)

відносяться грамнегативні, що не утворюють спор, палички, які

зброджують лактозу з утворенням кислоти та газу за температури

(36 +- 1) град. С протягом (24-48) годин і в яких відсутня

оксидазна активність.

5.9.2. Сутність методу

Сутність методу полягає у визначенні наявності ЛКБ (загальних

коліформ) у паперу (картону) шляхом посіву проби в живильне

середовище накопичення (Кеслера), вирощування за температури

36 +- 1,0 град. С з наступним висівом на селективне середовище

Ендо і диференціацією колоній.

5.9.3. Приготування проб для посіву і проведення випробування

Із зразка, відібраного згідно з пунктом 5.1, готують наважку

, нарізають дрібними квадратами і вносять у стерильну ємність

дезінтегратора з 200 куб.см середовища Кеслера, дезінтегрують до

повного розщеплення волокон і отримання однорідної маси, яку

переносять у стерильний флакон об'ємом 500 куб.см у разі

використання стерильних поліетиленових пакетів у дезінтеграторі

типу "Stomacher".

Підготовлену таким чином пробу розміщують у термостаті за

температури 36 +- 1 град. С на 48 годин.

Під час обліку результатів відмічають наявність ознак росту

мікроорганізмів: помутніння середовища і утворення пухирців газу,

помутніння середовища без наявності газу. Відсутність ознак росту

через 48 годин свідчить про негативний результат - відсутність ЛКБ

у 5 г паперу (картону). За наявності ознак росту роблять пересів

на середовище Ендо так, щоб отримати ізольовані колонії

(відсутність ізольованих колоній не дає змоги продовжувати аналіз

і потребує розсіву для отримання росту ізольованих колоній).

Чашки з середовищем Ендо інкубують при 36 +- 1 град. С

протягом 16-18 годин.

Під час урахування результату пересіву із середовища

накопичення на середовище Ендо можливі два основні варіанти:

- на чашках або окремих секторах відсутній ріст колоній або

виросли не типові для ЛКБ колонії (блідо-рожеві, плівчасті,

зморщені, губчасті з нерівними краями тощо). Відмічають

відсутність ЛКБ у досліджуваній пробі;

- на чашках або секторах Ендо виросли типові для ЛКБ колонії:

темно-червоні та червоні з металевим блиском або без нього, рожеві

з червоним центром і відбитком на середовищі, що вказує на

ферментацію лактози і утворення альдегіду. Їх належність до ЛКБ

підтверджують мікроскопією і постановкою оксидазного тесту. При

виявленні оксидазонегативних, грамнегативних паличок колонії

кожного типу засівають уколом у напіврідке середовище з лактозою,

яке попередньо бажано підігріти до 37 град. С. При цьому забирають

якомога більше посівного матеріалу. Пробірки з посівами інкубують

у термостаті за температури 36 +- 1 град. С протягом 4-6 годин. За

утворення кислоти та газу дають позитивну відповідь. При

відсутності чіткого росту або утворенні тільки кислоти продовжують

інкубацію до 24 годин. Якщо виявлено тільки кислоту, то

досліджувані колонії не належать до ЛКБ. Ферментація лактози з

утворенням кислоти та газу свідчить про наявність ЛКБ у

паперу (картону), у цьому випадку видають позитивний результат.

5.10. Визначення патогенних мікроорганізмів, у т.ч. бактерій

роду сальмонела.

5.10.1. Визначення поняття показника

Сальмонели - це факультативно-анаеробні грамнегативні

неспороутворювальні палички, які добре ростуть на простих поживних

середовищах, рухливі, крім S. gallinarum-pullorum. При ферментації

глюкози утворюють газ за невеликим винятком (S. typhi, S.

typhisuis та ін.), не ферментують лактозу та сахарозу, продукують

сірководень. Ідентифікацію сальмонел проводять за рядом

біохімічних тестів та за антигенною структурою, що виявляється в

реакції аглютинації на склі з О- та Н- аглютинувальними

сироватками.

5.10.2. Принцип методу

Метод полягає в накопиченні сальмонел у селективних рідких

поживних середовищах, селекції на двох різних

диференційно-діагностичних поживних середовищах та ідентифікації

виділених мікроорганізмів за біохімічними і серологічними

ознаками.

5.10.3. Приготування проб для посіву і проведення

випробування

Із зразка, відібраного згідно з пунктом 5.1, готують дві

наважки по , нарізають дрібними квадратами і вносять одну з

них у стерильну ємність дезінтегратора з 200,0 куб.см селенітового

середовища, а другу - з 200,0 куб.см магнієвого середовища.

Наважки в середовищах дезінтегрують до утворення однорідної маси,

яку переносять у стерильні флакони об'ємом 400-500 куб.см, у разі

використання стерильних поліетиленових пакетів у дезінтеграторі

типу "Stomacher".

Підготовлену таким чином пробу розміщують у термостаті за

температури 36 +- 1 град. С на 24 години (селенітове середовище)

та протягом 48 годин (магнієве середовище).

З обох середовищ виконують пересів на щільні

диференційно-селективні середовища: чашки з вісмут-сульфіт агаром,

середовищем Ендо і Плоскірєва. Чашки інкубують за температури

36 +- 1 град. С протягом 24 годин, з вісмут-сульфіт агаром - 48

годин.

Після інкубації чашки переглядають і відзначають підозрілі на

сальмонели колонії. На середовищах Ендо, Плоскірєва - це безбарвні

або блідо-рожеві злегка опуклі блискучі колонії.

На вісмут-сульфіт агарі колонії сальмонел сіро-чорні з

металевим блиском навкруги. Середовище під колонією набуває

чорного забарвлення. Можливий ріст колоній з чорним центром і

напівпрозорим краєм, а також невеликих плоских колоній

темно-зеленого кольору. У міру старіння колоній з'являються

піднятий центр і валик навколо центру.

Колонії сальмонел легко знімаються з агару, їм не властива

слизувата або клейка консистенція.