Залишок матеріалу використовують для засіву на стерильність (середовище 199 без антибіотиків, бульйон та ін.).
Заражені ембріони інкубують в термостаті при 33-34 град.C 72 години, після чого охолоджують на протязі 16 годин при 4 град.C або 30 хвилин при - 20 град.С. Після охолодження пастерівською піпеткою відбирають в стерильні пробірки рідину з амніотичної та алантоїсної порожнини і перевіряють її на вміст вірусу грипу в реакції гемаглютинації (РГА).
РГА ставлять з використанням 1% суспензії еритроцитів морської свинки (або людини 0 групи, які можуть бути більш чутливі для виявлення вірусу при ранніх пасажах). Курячі еритроцити рекомендують застосовувати, коли вірус вже адаптований до курячих ембріонів. Для збільшення титрів до рівня, який може визначитися в реакції гемаглютинації, інколи необхідно додатково зробити 2-3 "сліпих" пасажі.
Зібрану рідину, яка містить вірус, освітлюють центрифугуванням 10 хвилин при 10 тис.обертів і зберігають надосад при 4 град.C до наступного зараження курячих ембріонів. Якщо алантоїсна рідина містить вірус, перед інокуляцією її розводять розчином Хенксу або забуференим фізрозчином до концентрації вірусу 10 - 100 ГАО/мл.
Для виділення вірусу грипу С матеріал необхідно вводити тільки в амніотичну порожнину (вірус не репродукується в алантоїсній) 7-денних ембріонів (під контролем овоскопу, ембріон знаходиться в горизонтальному положенні) і інкубують при 33 град.C п'ять діб.
При використанні пермісивних для вірусу грипу культур клітин спостерігають цитопатичні зміни у вигляді легкої вакуолізації або прозорості клітин, які швидко дегенерують. Цитопатична дія (ЦПД) може проявитись лише після кількох "сліпих" пасажів. Присутність вірусу в клітинах визначається в реакції гемадсорбції, яка значно випереджає появу ЦПД. Реакція ставиться із свіжими еритроцитами морської (гвінейської) свинки. Гемадсорбцію починають ставити та враховувати з контрольних незаражених пробірок, з яких зливають підтримуюче середовище. В кожну пробірку додають по 0,1 мл розчину Хенксу і 0,2 мл 0,4% суспензії із еритроцитів морської свинки. Пробірки з культурою залишають клітинами вниз на 10 хвилин при 18-20 град.C. При позитивній гемадсорбції в полі зору мікроскопа клітини, щільно вкриті прикріпленими еритроцитами, що не змиваються при струшуванні. Позитивна гемадсорбція в контрольних пробірках свідчить про те, що культури містять сторонній гемадсорбуючий агент, тому необхідно повторити дослід на іншій партії культур клітин.
Якщо в контролях гемадсорбція негативна, враховують реакцію в інших дослідних пробірках. При негативній гемадсорбції пробірки струшують і вдруге враховують ще раз через 10 хв. Якщо при повторному обліку реакція негативна, ці проби використовують для наступного пасажу. При позитивній гемадсорбції з культуральним середовищем ставлять реакцію гемаглютинації з 0,4% суспензією еритроцитів морської свинки (або "0" групи крові людини) і 0,5% суспензією еритроцитів курей.
Якщо титр гемаглютинінів в якій-небудь культуральній рідині 1:8 або більше - цей зразок залишають для первинної ідентифікації реакції інгібіції гемаглютинації (РІГА) з комерційними діагностичними сироватками (як вказано в поясненні до них).Реакцію ставлять при кімнатній температурі. В разі негативної РІГА - пробу повторюють, інкубуючи суміші розведених діагностичних сироваток з дозами вірусу при 4 град.C протягом ночі, проводячи реакцію на лотках з льодом.
Якщо в пробах з позитивною гемадсорбцією титр гемаглютинінів 1:4 або менше (з еритроцитами морської свинки і курки) матеріал використовують для подальших пасажів.
Перед відправленням в Український центр грипу для їх подальшого вивчення виділені ізоляти ще раз пасують в курячих ембріонах для підвищення титру та одержання більшого об'єму.
Виділення та ідентифікація інших респіраторних вірусів
Ізоляція аденовірусів. Аденовіруси можуть бути ізольовані від хворих до 7 дня від початку захворювання з слизу носа, горла, кон'юнктиви та секційного матеріалу.
Змиви після доставки в лабораторію для зберігання до засівання швидко заморожують в суміші сухого льоду із спиртом при -70 град.C. Зберігають проби після заморожування при - 15 - 20 град.C до 7 днів.
Матеріалом заражують по 4 пробірочних культури клітин нирок ембріона людини, HELA або HEP-2.
Інкубація продовжується 5-6 годин, після чого в пробірки додають підтримуюче середовище (середовище 199 з 5% сироватки новонароджених телят або 5% лактальбуміну).
Для аденовірусів характерна епітеліотропність, специфічний тип дегенерації клітин культури і швидке підкислення середовища. При необхідності пасування культуральну рідину зливають, клітинний шар механічно руйнують, і клітини разом із залишками середовища об'єднуют в одну пробірку. Потім пробірки 3 рази швидко заморожують і відтаюють, центрифугують і надосад використовують для наступного пасажу. При наявності характерної дегенерації клітин вміст пробірок об'єднують, двічі заморожують, - розморожують та інфікують культуру клітин як нерозведеним вірусом, так і розведеним від 10 з відхиленням в I логарифм (по 4 пробірки). Результати титрування обробляють статистично за Рідом і Менчем, а титр виражають в ТЦД 50/0,2 мл.
Ідентифікацію цитопатогенного агента з аденовірусами проводять також за допомогою реакції зв'язування комплементу (РЗК) згідно з інструкцією.
Для доказу того, що виділений цитопатогенний агент викликав захворювання у хворого, ставлять реакцію нейтралізації цитопатогенної активності вірусу парними сироватками хворого, які відбирають на початку захворювання та після 2-4 тижнів. Сироватки попередньо звільняють від неспецифічних інгібіторів. Антиген в дозі 100 ТЦД 50/0,2 мл змішують з рівними об'ємами розведень першої і другої сироваток, інкубують 1 годину при 37 град.C, і суміш антигену з антитілами по 0,2 мл інокулюють в культури клітин.
Контролі: дози вірусу та сироваток, незаражені культури тканини. Якщо виділений агент викликав захворювання, титр нейтралізації другої сироватки повинен бути в 4 і більше разів вищим, ніж перший.
Виділення РС-вірусу (респіраторно-синцитіального).
Вірус відрізняється надзвичайною лабільністю і низьким титром в секретах хворого, що практично робить неможливим його ізоляцію із проб, які довго зберігалися. В зв'язку з цим слід доставляти чутливу культуру клітин (лінії HEP-2, HELA-сублінії Брістоль, клітини нирок ембріона людини) до ліжка хворого, де й проводять зараження. Якщо це неможливо, змиви із носа та глотки хворих дітей переносять у пробірки (склад середовища зазначений вище). Все це енергійно струшують і ставлять у льодову баню. Не допускається заморожування! В перші години після відбору матеріалу здійснюється інокуляція чутливих культур клітин. До складу культурального середовища для виділення РС-вірусів сироватки дорослих тварин не включають, бо вони можуть містити антитіла або інгібітори до РС-вірусу. Замість них використовують ембріональну телячу сироватку або БСА.
Заражену культуру інкубують при 37 град.C не менше 3-х тижнів, регулярно змінюючи середовище. ЦПД інфікованої тканини у вигляді синцитію спостерігається не завжди, що визначається багатьма факторами, в тому числі штамом вірусу, умовами культивування та типом клітин. Обробка клітин або проби ДЕАЕ-декстраном підвищує чутливість клітин до РС-вірусу. Кількість клітин, заражених РС-вірусом людини, може збільшуватись в 100 разів при додаванні 15 мгк/мл ДЕАЕ-декстрану. В присутності високих концентрацій (близько 40%) сахарози інфекційність РС-вірусу стабілізується.
В культуральній рідині інфікованих клітин гемаглютинін РС-вірусу не виявляється. Адсорбція еритроцитів на клітинах, заражених РС-вірусом людини, не описана.
Індикація персистентного РС-вірусу в інфікованих клітинах здійснюється за допомогою імунофлюоресцентного забарвлення з поліклональною антисироваткою або твердофазного імуноферментного аналізу. При наявності дегенерації 75% клітинного шару в культурах клітин, в культуральній рідині визначають антиген РС-вірусу в РЗК з антитілами до еталонного штаму РС-вірусу. Реакцію нейтралізації для типування виділених РС-вірусів ставлять за загальноприйнятою методикою з використанням імунних сироваток морських свинок.
Виділення парагрипозних вірусів (ПГВ).
Для виділення ПГВ використовують культуру ниркової тканини із 12-тижневих ембріонів людини (НЕЛ). Ідентифікація виділених штамів провадиться в реакції нейтралізації імунними сироватками в культурах клітин, в реакції затримання гемадсорбції та РІГА з еритроцитами морської свинки, курки та людини.
Реакцію гемадсорбції ставлять з 0,4% суспензією стерильних еритроцитів морської свинки (0,2 мл), які вносять в заражені і контрольні пробірки без попереднього вилучення підтримуючого середовища. Штатив з пробами витримують клітинним моношаром вниз при 4 град.C 30-40 хвилин. Гемадсорбція спостерігається не раніше 4-5 днів після зараження культури клітин.
При негативних результатах, особливо в першому пасажі, пробірки з культурою клітин витримують в термостаті до 20 днів, гемадсорбцію ставлять через кожні 5 днів. Після другої реакції проводять часткову заміну середовища.
Ідентифікацію вірусів парагрипу здійснюють шляхом постановки реакції інгібіції гемадсорбції (РІГ) чи в реакції нейтралізації (РН).
РІГ ставиться на 15 пробірках HELA, в які вносять по 0,2 мл матеріалу, що дав в попередньому пасажі позитивну гемадсорбцію. Підтримуюче середовище - середовище 199 без сироватки, інкубація - при 37 град.C. На 5 день зливають середовище, відмивають клітини розчином Хенкса і вносять в кожні 3 пробірки по 0,2 мл гіперімунної кролячої сироватки до 1,2; 3 і 4 типів вірусу ПГ в розведенні 1:10, а потім додають по 0,6 мл розчину Хенкса. Контакт 20 хвилин при 20 град.C, після чого в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4% суспензії еритроцитів морської свинки і ставлять культуру на 30 хвилин при 4 град.C. Гемадсорбція відсутня в контролях культури і в тих пробірках, де тип вірусу збігся з типом однієї із гіперімунних сироваток.
Реакцію нейтралізації ПГ вірусів ставлять із 100 гемадсорбуючими одиницями в об'ємі 0,2 мл. Цю дозу з'єднують з 0,2 мл специфічної імунної сироватки кожного типу в розведенні 1:10 - 1:20 (з титром антитіл 1:80 - 1:160). Після 2-годинного контакту при 20 град.C в пробірки з культурою клітин вносять по 0,2 мл суміші антигену з антитілом, добавляють середовище 199 і інкубують при 37 град.C. Для кожного типу сироватки беруть по три пробірки. Ставлять контроль вірусу.
Через 4-5 днів в усі пробірки вносять по 0,2 мл суспензії еритроцитів і реєструють наявність або відсутність гемадсорбції. При позитивній реакції гемадсорбції в контролях вірусу, її відсутності в контролях культури та в пробірках, в які були внесені суміші вірусу і сироватки певного типу, все це свідчить про ідентичність виділеного вірусу даному типу сироватки.
Методи експрес-діагностики: люмінесцентної мікроскопії, імуноферментного аналізу та реакція пасивної гемаглютинації
Методи експрес-діагностики у своїй основі мають виявлення вірусних антигенів в мазках із зіву та носа хворих за допомогою специфічних противірусних глобулінів, мічених флуорохромами або ферментами. Ці методи використовуються в лабораторіях інфекційних стаціонарів для з'ясування природи гострих респіраторних інфекцій з метою:
- своєчасного призначення специфічних засобів етіотропної терапії;
- прогнозування подальшого перебігу хвороби і одужання;
- раціонального розміщення хворих за етіологічною ознакою.
Методи ранньої лабораторної діагностики використовують також для термінового розшифрування причин епідемічних спалахів з метою своєчасного проведення відповідних профілактичних і лікувальних заходів.
Поряд з імунофлуоресцентним методом діагностики грипу і ГРІ впроваджується метод імуноферментного аналізу.
Для експрес-діагностики аденовірусної інфекції використовують реакцію пасивної гемаглютинації з еритроцитарним діагностикумом.
Метод імунофлуоресцентної діагностики грипу та інших ГРІ
Імунофлуоресцентний метод (ІФМ) використовують для швидкої діагностики грипу, парагрипу, адено-, РС-вірусної інфекції та мікоплазми пневмонії, а також змішаних інфекцій.
В основі методу лежить здатність антигенів вступати в реакцію із специфічними противірусними антитілами, міченими флуорохромом.
Діагностика здійснюється у двох напрямках:
1. Виявлення вірусного антигену в клітинах циліндричного епітелію слизової оболонки носоглотки або у відбитках із секційного матеріалу;
2. Виявлення вірусного антигену в культурах клітин, інфікованих матеріалом від хворих.
Використовують прямий і непрямий методи імунофлуоресценції. При прямій модифікації методу використовують комерційні флуоресцентні глобуліни проти вірусів грипу, парагрипу, аденовірусів, РС-вірусів та інших. Для непрямого методу використовують противірусні імунні сироватки різних видів тварин і відповідні антивидові флуоресціюючі глобуліни.
З допомогою ІФМ етіологічний діагноз можна встановити через 2-3 години при дослідженні препаратів від хворих і через 24-48 годин - при зараженні культури клітин. Ефективність досліджень найвища в гострій фазі захворювання (перші 3 дні) і суттєво залежить від якості відбору матеріалу, приготування препаратів.
Взяття матеріалу для дослідження ІФМ.
Матеріалом для дослідження служать епітеліальні клітини зіву і носа. Перед введенням тампона ніс звільняють від слизу. Сухий стерильний тампон вводять у порожнину носа хворого по зовнішній стінці, злегка опускають донизу, вводять в нижній носовий хід на глибину 2-, вільною рукою злегка натискають на зовнішню стінку носа і обертовим рухом старанно знімають десквамований епітелій. Тампон опускають в пробірку з 2 мл ФБР. Іншими тампонами збирають матеріал з другої половини носа, а також із задньої стінки ротоглотки. Матеріал, взятий від хворого, необхідно швидко (не пізніше 4-х годин) передати в лабораторію, а до цього зберігати в холодильнику при температурі 4 град.C.
