Волинська (п'ятиденна) гарячка при значному поширенні в Україні не реєструється через труднощі в клінічній діагностиці, а лабораторні методи практично не застосовуються.
Гарячка Ку має строкату, поліморфну клінічну картину. Виділяють різні форми: грипоподібну, септичну, бронхопневмонічну, нервову, субфібрильну, латентну та інші. Діагностичні помилки зводяться, в основному, до встановлення діагнозу грипу в 35,9%, черевного тифу - 32,8%. Діагностика спорадичних випадків, при відсутності епідеміологічних даних, практично неможлива без лабораторних досліджень, а хронічні та латентні форми хвороби діагностуються тільки лабораторно. Навіть під час епідемічних спалахів гарячки Ку у раніше невідомих ендемічних вогнищах коксіельозу в західному регіоні України, в жодному випадку не було поставлено клінічного діагнозу, і лише застосування, в ході епідеміологічного обстеження, серологічних методів досліджень допомогло провести етіологічну розшифровку спалахів.
Аналогічна ситуація спостерігалась під час епідемічного спалаху кліщового рикетсіозу (марсельської гарячки) в АР Крим, в невідомому раніше ендемічному вогнищі. Використанням лабораторних методів виявили не тільки клінічно виражені форми захворювань в епідемічних (сімейних) вогнищах інфекції, а й атипові та безсимптомні форми у осіб, які не звертались за медичною допомогою і вважали себе здоровими або перенесли невідоме гарячкове захворювання. Питома вага таких хворих під час епідемічних спалахів становила 25-30% і більше. В епідемічних вогнищах діагностувались захворювання і ретроспективно.
Враховуючи труднощі клінічної діагностики, провідне місце в системі епідеміологічного контролю за рикетсіозами займають лабораторні методи досліджень. Вони обов'язкові для підтвердження як спорадичних, так і епідемічних захворювань.
Організація роботи лабораторій
Ефективна діагностика рикетсійних захворювань можлива при забезпеченні єдиної системи організації роботи лабораторій і проведення досліджень в країні.
При діагностиці висипного тифу і хвороби Бриля обов'язкове застосовування реакцій зв'язування комплементу, непрямої гемаглютинації та аглютинації з антигенами рикетсій Провачека. Первинну (скринінгову) лабораторну діагностику висипного тифу (хвороби Бриля) здійснюють за допомогою реакції аглютинації рикетсій у всіх лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладів, інфекційних лікарнях. Для постановки реакції аглютинації використовується антиген рикетсій Провачека, культивований за методом Вейгля, виробництва ДП "Львівдіалік". Природне забарвлення антигену забезпечує більш чіткі результати реакції, що зменшує елемент суб'єктивності при обліку результатів. При відсутності такого антигену може бути використаний безбарвний антиген для реакції аглютинації виробництва НВО "Біомед", м. Перм.
В більш потужних лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладів, інфекційних лікарень та в лабораторіях відділів ОНІ обл(міськ)санепідстанцій поряд з реакцією аглютинації, застосовують реакції зв'язування комплементу та непрямої гемаглютинації; в лабораторіях відділів ОНІ - також метод флуоресціюючих антитіл.
Лабораторна діагностика гарячки Ку, рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки та волинської (п'ятиденної) гарячки здійснюється за допомогою реакції зв'язування комплементу з відповідними рикетсійними антигенами в лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладах, інфекційних лікарнях, при наявності в них відповідних умов та імунобіологічних препаратів, а також лабораторіях відділів ОНІ обл (міськ) санепідстанцій де, крім реакції зв'язування комплементу, застосовують метод флуоресціюючих антитіл.
Усі сироватки з позитивними або сумнівними результатами надсилають в лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій обл(міськ)санепідстанцій для контрольних досліджень.
Лабораторії відділів ОНІ обл(міськ)санепідстанцій здійснюють:
- організаційно-методичну роботу з лабораторної діагностики рикетсіозів в областях, аналіз стану і ефективності її в області та по кожному районі, в тому числі в сільській місцевості, підготовку спеціалістів на робочих місцях;
- діагностичні дослідження на рикетсіози в реакціях зв'язування комплементу, непрямої гемаглютинації, аглютинації рикетсій, методі флуоресціюючих антитіл, а також контрольні дослідження позитивних та із сумнівними результатами сироваток крові хворих, що надсилають рай (міськ) санепідстанції; направлення позитивних сироваток в Український центр з рикетсіозів МОЗ України;
- дослідження (індикація збудника) експресними методами (методи флуоресціюючих антитіл, реакції непрямої гемаглютинації, нейтралізації антитіл - РНАТ) біологічного матеріалу (воші, кліщі, органи тварин тощо) та об'єктів довкілля (при необхідності);
- аналіз забезпечення імунобіологічними діагностичними препаратами лабораторій, що здійснюють діагностику рикетсіозів;
Центральна санепідстанція МОЗ України здійснює:
- організаційно-методичну роботу з лабораторної діагностики рикетсіозів в країні, контроль правильності та ефективності використання методів дослідження, діагностичні дослідження на рикетсіози;
- дослідження (індикація збудника) методами експрес-діагностики (флуоресціюючі антитіла, реакції непрямої гемаглютинації, нейтралізації антитіл - РНАТ) біологічного матеріалу (воші, кліщі, органи тварин тощо) та об'єктів довкілля (при необхідності);
- аналіз стану лабораторної діагностики та підготовку спеціалістів на робочих місцях;
Український центр з рикетсіозів МОЗ України здійснює:
- консультативні та підтверджуючі дослідження сироваток крові хворих, в тому числі для диференціації первинної і повторної висипнотифозної інфекції, гострої та хронічної форм гарячки Ку шляхом визначення класів імуноглобулінів;
- індикацію та ідентифікацію збудників в біологічних об'єктах з вогнищ інфекції;
- контрольні дослідження антигенних діагностичних препаратів та розробку нових ІБП;
- підготовку спеціалістів на семінарах та робочих місцях.
- розробка нових методів лабораторної діагностики рикетсіозів.
Лабораторна діагностика рикетсіозів
1. Серологічні методи діагностики рикетсіозів
Серологічні методи діагностики рикетсіозів, основані на виявленні в крові хворого антитіл, - високо специфічні і чутливі, дозволяють проводити не тільки міжгрупову, але й внутрішньогрупову диференціацію збудників. Серологічні реакції із специфічними рикетсійними антигенами в різних варіантах: реакції зв'язування комплементу (РЗК), непрямої гемаглютинації (РНГА), аглютинації рикетсій (РАР) та методи флуоресціюючих антитіл - прямий (МФА) і непрямий (нМФА), розроблені і апробовані стосовно всіх груп рикетсіозів. Інші серологічні тести, зокрема - реакція нейтралізації токсичної субстанції рикетсій (РНТСР), імуноферментного аналізу (ІФА) та інші, сьогодні не можуть бути рекомендовані для широкого практичного застосування в Україні через відсутність необхідних умов для роботи із збудниками та відповідних тест-систем.
Вірогідність результатів серологічних методів діагностики визначається в значній мірі якістю діагностичних антигенних препаратів та інших інгредієнтів, що застосовуються в цих реакціях. Тому контроль специфічності та чутливості інгредієнтів при відтворенні серологічних тестів, а також термінів їх придатності і умов зберігання є обов'язковим для забезпечення якісної діагностики.
1.1. Реакція зв'язування комплементу
Реакція зв'язування комплементу (РЗК) є високо специфічним і чутливим лабораторним методом діагностики рикетсіозів, дозволяє визначати в крові специфічні комплементзв'язуючі антитіла як при гострому захворюванні, так і анамнестичного характеру - після перенесеного в минулому захворювання. Тому РЗК є придатною для поточної і ретроспективної діагностики рикетсіозів та вивчення імунологічної структури населення при епідеміологічних обстеженнях.
Суть методу полягає у зв'язуванні комплементу специфічним комплексом антиген + антитіло, що визначається в присутності індикатора - баранячих еритроцитів, сенсибілізованих гемолітичною сироваткою. При утворенні специфічного комплексу антиген + антитіло доданий комплемент зв'язується цим комплексом, внаслідок чого після додавання гемолітичної системи не виникає лізис баранячих еритроцитів. Якщо ж комплекс антиген + антитіло не утворюється, вільний комплемент забезпечує лізис сенсибілізованих еритроцитів (гемоліз). При позитивному результаті РЗК спостерігається затримка гемолізу і еритроцити осідають на дно пробірки; при від'ємному результаті РЗК спостерігається феномен гемолізу, рідина забарвлюється гемоглобіном.
Для постановки РЗК необхідно мати такі інгредієнти: досліджувану сироватку; діагностикум; комплемент; гемолітичну сироватку; еритроцити барана.
Реакцію проводять в об'ємі 1,0 мл, тобто по 0,2 мл кожного інгредієнта (класичний варіант реакції) або в об'ємі 0,5 мл - по 0,1 мл кожного інгредієнта.
Обов'язковою умовою постановки РЗК є використання точно відтитрованих інгредієнтів.
Для забезпечення вірогідності одержуваних результатів необхідно користуватись окремим посудом (пробірки, піпетки, колби), добре вимитим і висушеним в сухожаровій шафі. Для кожного інгредієнта реакції використовують окрему піпетку. Для розведення інгредієнтів використовують свіжо виготовлений стерильний ізотонічний (0,9%) розчин хлориду натрію в дистильованій воді (далі в тексті - фізіологічний розчин).
Першу фазу реакції, тобто зв'язування комплементу, можна проводити при температурі 37 град. С або шляхом тривалого зв'язування на холоді (4 град. С). Останній спосіб більш чутливий, ніж перший, однак потребує більш тривалого часу для завершення дослідження (біля .). Тому для досліджень звичайно застосовують метод постановки РЗК в умовах термостату, що дозволяє завершити дослідження протягом одного дня.
Досліджувані в РЗК сироватки мають бути відділені від еритроцитів, не мати ознак сильного гемолізу і бактерійного забруднення, оскільки будуть проявляти антикомплементарну дію. Напередодні або в день постановки РЗК сироватки необхідно інактивувати у водяній бані при 56 град. С протягом 30 хвилин для звільнення від комплементу; сироватки інактивують не розведені або в розведенні 1:5, 1:10.
Рикетсійні діагностикуми, що використовують для РЗК, повинні відповідати таким вимогам: бути специфічними, містити не менше двох антигенних одиниць в робочому розведенні і не проявляти антикомплементарної дії. Антигени титрують на підприємствах, що виготовляють їх. Тому для РЗК використовують антигени в робочому розведенні згідно паспортних даних підприємства. Кожну нову одержану серію антигена необхідно перевірити на специфічність та чутливість постановкою РЗК із типовою специфічною та гетерологічною сироватками. Антиген повинен реагувати в РЗК до титру сироватки.
Для титрування діагностикум розводять фізіологічним розчином в ряд пробірок 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. В 3 ряди пробірок додають по 0,2 мл кожного розведення антигена (в перші пробірки наливають по 0,2 мл розчиненого, але не розведеного антигена). Потім до антигена додають: в перший ряд пробірок по 0,2 мл специфічної стандартної сироватки в чотирьохразовому титрі (при титрі 1:320 беруть 1:80), в другий ряд - по 0,2 мл неспецифічної протирикетсійної сироватки в розведенні 1:20, в третій ряд - по 0,2 мл фізіологічного розчину. Паралельно ставлять контроль специфічної і неспецифічної сироваток на антикомплементарність: в окремі 2 пробірки наливають по 0,2 мл сироватки (в тому ж розведенні, що і в досліді), а замість антигена додають по 0,2 мл фізіологічного розчину.
Потім у всі пробірки додають по 0,2 мл комплементу в робочій дозі (див. титрування комплементу) і ставлять контроль комплементу (0,2 мл комплементу + 0,4 мл фізіологічного розчину). Пробірки струшують і поміщають на одну годину в термостат (37 град. С). Після експозиції додають гемолітичну систему (див. нижче), пробірки знову після струшування вміщують в термостат на 20-30 хвилин до завершення гемолізу в контролях і враховують результат. За титр антигена приймають його розведення, в якому спостерігається затримка гемолізу не менше ніж на 3+ при 4-плюсовій шкалі оцінки гемолізу. Схема титрування антигена наведена в таблиці 1.
Комплемент - свіжовиготовлений (сироватка крові від 2-3 морських свинок, взятої напередодні досліду) або консервований - титрують кожний раз в день постановки досліду. Для тривалого зберігання свіжовиготовлений комплемент стерильно розливають у пробірки і заморожують в рефрижераторі при температурі - мінус 10-мінус 20 град. С. Заморожування-розморожування комплементу не допускається, оскільки він втрачає свою активність.
Гемолітичну сироватку, котра являє собою сироватку крові кроля, імунізованого за певною схемою суспензією еритроцитів барана, титрують на підприємстві, що виготовляє цей препарат. На етикетці ампули гемолітичної сироватки вказано її титр. Для постановки РЗК використовують гемолітичну сироватку у робочому титрі, який у три рази менший розведення, вказаного на етикетці. Наприклад, титр гемолітичної сироватки, за паспортними даними, дорівнює 1:1800, робочий титр її має бути 1:600.
При необхідності (тривале зберігання сироватки, одержання нечітких результатів реакції з досліджуваними сироватками) проводять титрування гемолітичної сироватки на місці. Доцільно титрувати гемолітичну сироватку також при одержані нових серій. Для цього готують розведення гемолітичної сироватки 1:100 (0,1 мл гемолітичної сироватки + 9,9 мл фізіологічного розчину), з якого проводять подальші розведення сироватки залежно від титру її, вказаного на етикетці (звичайно від 1:600 до 1:3000).
В ряд пробірок послідовно розливають по 0,2 мл кожного розведення сироватки; користуючись однією піпеткою, відмірювання проводять в зворотному порядку, починаючи з максимального розведення сироватки. В кожну пробірку додають по 0,2 мл комплементу в розведенні 1:10 та по 0,2 мл 3%-ої суспензії еритроцитів барана; потім доливають в кожну пробірку по 0,4 мл фізіологічного розчину. Суміш компонентів старанно перемішують, витримують в термостаті (37 град. С) протягом години і враховують результат. За титр гемолітичної сироватки приймають максимальне її розведення, здатне викликати повний гемоліз еритроцитів барана. Схема титрування гемолітичної сироватки наведена в таблиці 2.
