|
Показатели токсикометрии, |
Классы токсичности |
|||
|
мг/кг |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
1. DL50 в/ж |
<100 |
100—1000 |
1001—10000 |
>10000 |
|
2. DL50 при нанесении на кожу |
<100 |
100—500 |
501—2500 |
>2500 |
8.10. Дополнительно по данным острого опыта рассчитываются параметры, дающие первое представление о способности веществ к кумуляции: среднее время гибели (ТL50) и индекс кумуляции [1].
8.10.1. Для определения TL50 сопоставляется рабочая таблица, аналогичная таблице учета результатов острого опыта, сроки гибели животных выражаются в часах. По таблице подсчитывается суммарное время гибели животных от каждой из испытанных доз (?? t), из которых находят среднее время гибели одного животного (tn) по формуле: tn= ?? t/n, где n - общее количество животных, погибших от данной дозы. TL50 рассчитывают теми же статистическими методами, что и среднесмертельную дозу или строят прямоугольную систему координат (в логарифмическом масштабе), откладывая по оси абсцисс время гибели животных (в часах), а по оси ординат - изученные в опыте дозы вещества (в мг/кг). На график наносят точки, соответствующие ранее найденным значениям tn и через них проводят прямую, по которой находят TL50 - время гибели животных от дозы, равной DL50.
Таблица 8.3
Классификация веществ по способности к кумуляции в острых опытах
|
Степень |
Показатели кумуляции |
Прогноз МНД по индексу |
|
|
кумуляции |
I |
TL50, ч |
кумуляции |
|
1. Сверхкумуляция |
>0,5 |
>48 |
1/250000 DL50 |
|
2. Сильная |
0,1—0,5 |
>24—48 |
1/50000 DL50 |
|
3. Средняя |
<0,1 |
12—24 |
1/10000 DL50 |
|
4. Слабая |
0 |
<12 |
1/2000 DL50 |
По таблице 8.3 определяют, к какому классу по способности к кумуляции относится вещество. Если TL50 находится в пределах 12— 48 часов, допустимо применять расчетные уравнения для прогноза ПДхр. и МНД в соответствии с [4].
Для определения индекса кумуляции рассчитываются величины DL50 за 1 сутки (Д1) и по результатам гибели животных в течение всех 14 дней опыта (Д2). Затем определяют I:
I = 1 - Д2 / Д1
Классификация способности веществ к кумуляции и ориентировочные величины МНД приведены в таблице 8.3.
9. Порог вредного действия при однократном поступлении
вещества в организм
Цели исследований:
• определить верхний предел доз для подострого эксперимента и оптимальное время наблюдения после введения вещества;
• получить характеристику кумулятивных свойств;
• при необходимости - изучить токсикокинетику и процесс детоксикации вещества;
• рассчитать зону острого действия.
9.1. Порог однократного действия определяется на белых крысах по интегральным и специфическим показателям с обязательным определением изменений в динамике в течение суток (или нескольких суток - в зависимости от TL50). Время первого определения устанавливается, исходя из клинической картины отравления в остром опыте, но не позднее двух часов, затем, например, через 4—6—12—24 часа после затравки, а также через 2—4 и 8 дней после нее. Возможны и другие сроки наблюдения с учетом токсикодинамики и/или токсикокинетики. Порог однократного действия может быть установлен эмпирически или рассчитан как вероятностная величина (Limac) или дополнен результатами токсикокинетических исследований.
9.2. Для специальных научных целей можно определить кинетику накопления и выведения вещества и/или его метаболитов в организме.
9.3. На основании исследования зависимости «время-эффект» можно определить время полуубыли (??) регистрируемого эффекта по формуле:
где
Ei - среднее значение степени эффекта (в % к параллельному контролю) в моменты времени ti (i - 1; 2;...; n);
0,693 - натуральный логарифм из 2;
2,3 - коэффициент перехода от натуральных логарифмов к десятичным.
Степень кумуляции определяют по величине ??: при ?? < 12, 12—24, 24—48 и > 48 часов кумулятивные свойства оценивают как слабые, средние, сильные и очень выраженные соответственно.
9.4. Пример определения пороговой дозы однократного действия в опыте с ацетонциангидрином (АЦГ).
При выборе доз и сроков наблюдения исходили из результатов острого опыта:
ЛД50 = 18,5 (16,9 : 20,3) мг/кг, TL50 = 85 мин. Первые признаки отравления появлялись через 10—15 мин после введения ацетонциангидрина. Эти данные свидетельствуют о быстром развитии токсического процесса и слабо выраженной кумуляции.
Поэтому выбран минимальный интервал между дозами. Вещество вводилось однократно белым крысам в дозах, составляющих 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 и 1/45 DL50. Отбор исследуемого материала /кровь, печень/ производили через 15, 30 мин, 1, 2, 4 и 6 часов после введения АЦГ. Контролем служили интактные животные. Поскольку механизм токсического действия цианидов хорошо известен, исследовались только специфические показатели: содержание оксигемоглобина и роданидов в крови, активность цитохромоксидазы печени. Установлено, что максимальный токсический эффект (пик содержания оксигемоглобина и снижение активности цитохромоксидазы) для доз 1/5, 1/10, 1/15 DL50 наблюдается через 30 мин после введения вещества, а с уменьшением дозы (1/20, 1/45 DL50) срок достижения наибольших изменений увеличивается до 1 часа. Получены кривые зависимости «время-эффект» для разных доз.
По наиболее чувствительному показателю (изменению активности цитохромоксидазы) установлен порог однократного действия Limac, равный 1/45 DL50 (0,41 мг/кг). Зона острого действия DL50 /Limac=45. Это доказывает, что способность АЦГ к кумуляции слабо выражена.
Исходя из полученных данных, для подострого эксперимента были выбраны дозы < Limac, т.е. 0,4; 0,08; 0,015 мг/кг с пятикратным шагом между ними.
10. Изучение действия вещества на организм в условиях подострого опыта
Подострые опыты могут проводиться с целью:
• выявления различными методами способности веществ к кумуляции;
• получения данных для обоснования класса опасности вещества, необходимости оценки хронической токсичности, выбора доз и тестов при планировании хронического опыта.
Подострый эксперимент является центральным звеном в гигиенических исследованиях, от его результатов зависит решение вопроса о необходимости и целесообразности дальнейших исследований вещества и их планирование. В условиях подострого опыта могут оцениваться и продукты трансформации веществ 3 и 4 классов стабильности в случае, если они не изучались ранее или химически не идентифицированы, а в острых экспериментах оказались токсичнее исходного соединения.
10.1. Наибольшую информативную ценность представляет подострый эксперимент, направленный на установление параметров токсикометрии в условиях, вызывающих не явные признаки нарушения жизнедеятельности организма, а изменения функциональных показателей, близкие к пороговым (в отличие от методов оценки кумуляции Ю. С. Кагана и В. В. Станкевича; Lim et al; Б.М. Штабского, использующих дозы, приводящие к смертельному эффекту).
Подострый эксперимент позволяет:
• изучить токсикодинамику в рамках зависимости «доза-эффект» во времени;
• определить характер (механизм) токсического действия; наиболее поражаемые функции, органы, системы организма;
• установить пороговую дозу подострого эксперимента (ПДпэк);
• выявить способность вещества к кумуляции;
• рассчитать зону кумулятивного действия;
• установить класс опасности по кумуляции;
• прогнозировать пороговую дозу хронического действия (ПДхр.).
10.1.1. В эксперименте изучается не менее 3 доз вещества. Выбор доз осуществляется на основе прогноза ПДхр. и МНД с использованием математических моделей согласно п. 3.2.2., а также результатов определения Limac (раздел 9) [1,4].
Шаг между дозами определяется кумулятивностью вещества: 3—5-кратный - для 3—4 классов, 5—10-кратный - для 1—2 классов кумуляции.
10.1.2. Исследования проводятся, как правило, на белых крысах.
При выраженных (более 5 раз) различиях в видовой чувствительности обязательны дополнительные исследования на наиболее чувствительном виде животных. Вид подопытных животных определяется также особенностью биологических эффектов изучаемого вещества. Например, для изучения аллергенного эффекта используются морские свинки, для выявления мутагенного эффекта - специальные линии белых мышей, определения влияния на микрофлору кишечника - белые крысы и т. п.
10.1.3. Вещества вводятся в виде водного раствора внутрижелудочно (белые крысы) или перорально (кролики, морские свинки). Допустимо введение веществ в растительном масле или растворе крахмала. Если вещество хорошо растворяется в воде и не вызывает изменения ее органолептических свойств, предпочтительнее использовать автопоилки с ежедневным определением количества выпитого раствора. При понижении водопотребления по сравнению с контрольными животными, следует переходить на активное запаивание (внутрижелудочное введение). Введение веществ ежедневное, включая выходные дни.
10.1.4. Длительность опыта - не менее 30 дней. Однако опыт может быть продлен до 2—3 месяцев, если известно, что изучаемый препарат вызывает изменение замедленно реагирующих систем, например, липидного обмена, костной системы, обмена кальция и т. п.
10.1.5. Точность и надежность обоснования гигиенического норматива в основном определяется адекватностью функциональных показателей, выбранных для оценки состояния организма животных в подостром (а затем, в хроническом) эксперименте. Поскольку невозможно рекомендовать универсальный перечень таких показателей в силу специфичности действия отдельных веществ на организм, комплекс изучаемых показателей должен быть тщательно обоснован в каждом подостром эксперименте. Выбор показателей осуществляется с учетом всех имеющихся данных о механизме токсического действия вещества и его структурных аналогов [5, 6, 7, 8]. Желательно, чтобы выбранные показатели отражали состояние крови, печени, почек, центральной нервной системы, функции наиболее поражаемых органов.
После снятия фоновых значений показателей наблюдения проводятся на 5—10—20 и 30 сутки опыта. Если не определялся порог однократного действия, необходимо исследование в 1 сутки. Если продолжительность опыта превышает 30 дней, последующие снятия значений показателей функционального состояния организма животных проводятся каждые 2 недели.
10.1.6. В подостром опыте применяются дополнительные функциональные (физическая, термическая и т. п.) или материальные (амидопириновая, гексеналовая и т. п.) нагрузки; однократно в конце опыта или через каждые 2 недели. Нагрузка должна в наибольшей мере соответствовать механизму действия вещества.
Наиболее предпочтительна нагрузка изучаемым веществом в конце эксперимента в дозах, превышающих порог однократного действия в 2—5 раз в зависимости от способности к кумуляции.
10.2. В конце подострого опыта определяется ПДпэк - доза вещества, при энтеральном поступлении которой в организм в течение 30 дней возникают минимальные, но диагностически значимые изменения функциональных показателей состояния организма животных. При этом важна дифференциация закономерных и случайных проявлений токсического действия веществ.
10.2.1. Необходимо использовать следующие диагностические критерии ПДпэк:
• комплексный анализ зависимости «доза-эффект» во времени для не менее 3 доз веществ, различающихся в 3—10 раз;
• учет изменений небольшого числа или даже одного показателя, если он отражает особенности механизма токсического действия изучаемого или близких по структуре соединений;
• ориентация на минимальные сдвиги значений функциональных показателей, наблюдаемые неоднократно (не менее 2-х раз) в течение эксперимента;
• учет тенденции к изменениям, даже при отсутствии статистически достоверных различий с контролем, если они относятся к жизненно важным показателям;
• наличие экспериментально установленной недействующей дозы подострого опыта как дополнительного критерия пороговости.
10.2.2. Статистическими критериями пороговой дозы служат показатели достоверности отличий от контроля (t - критерий Стьюдента, отношения дисперсий по критерию F и др.). Необходимо проверять правомерность применения этих критериев, т. е. соответствие изучаемой выборки закону нормального распределения. В противном случае применяются другие методы статистической обработки, в т. ч. непараметрические.
При выборе количественного критерия значимости отклонений от нормы (контроля) (5%, 1%, 0,1%) учитывается биологическая значимость показателя, степень «пластичности», патогенетического соответствия. Кроме того, чем опаснее для жизнедеятельности организма выявленный эффект или чем важнее сфера применения вещества и шире контакт с населением, тем статистически менее значимые сдвиги значений показателя по сравнению с контролем следует принимать во внимание.
10.2.3. Для большей надежности при установлении ПДпэк, следует применять комплексный диагностический подход с оценкой адаптационных возможностей организма, в частности, по реакции на материальную или функциональную нагрузку. Дополнительно могут использоваться также изучение соотношения между показателями индивидуально у каждого животного, учет дискоординации сопряженных функций, определение безвредных доз на основе зависимости «доза-статус организма».
10.3. После установления ПДпэк определяется способность веществ к кумуляции по отношению DL50/ПДпэк, класс опасности и коэффициент J для прогноза пороговой дозы хронического действия (табл. 10.2). Выбор коэффициента (J1, J2, J3) осуществляется в зависимости от степени изученности характера токсического действия вещества и структурного ряда, к которому оно принадлежит.
