Каждый показатель исследуется не менее, чем в 3-х сериях опытов.
7.4. Выбор концентраций для опыта проводят по данным о растворимости и стабильности вещества, величине химического потребления кислорода в расчете на 1 мг вещества.
В первой ориентировочной серии допустимы различия между концентрациями вещества в 10 раз, в последующих 3-х сериях исследуют 3—4 концентрации, отличающиеся одна от другой в 3—4 раза. Контролем служит разводящая вода без вещества.
7.5. В связи с высокой вариабельностью процессов самоочищения, как в скляночных опытах, так и в модельных водоемах, необходимо соблюдение ряда требований к разводящей воде и правилам ее подготовки.
В качестве источника органических веществ естественного происхождения и активной сапрофитной микрофлоры используют хозяйственно-бытовую сточную воду, которая должна быть свободна от примесей ингредиентов промышленных сточных вод и взвешенных веществ. Длительное хранение (более 24 ч) хозяйственно-бытовой жидкости при температуре 20 °С недопустимо. При проведении ориентировочных опытов готовая смесь этой жидкости с разводящей водой должна храниться в холодильнике при температуре 4— 8°С. Перед началом эксперимента перманганатным методом определяют окисляемость водной смеси с хозяйственно-бытовой сточной жидкостью. Если величина окисляемости выше 15 мг О2/л, сточная вода разбавляется. В качестве разводящей воды используется дехлорированная водопроводная вода, свободная от веществ, оказывающих влияние на процессы БПК. Вода насыщается кислородом воздуха до концентрации 6,0—8,0 мг/л. Сосуды для этой воды нельзя использовать для других целей. Целесообразно, чтобы аэрированная вода имела температуру около 20 градусов.
После разбавления окисляемость смеси не должна превышать 8—9 мг О2/л.
7.6. Определение окисляемости, БПК, аммиака, нитритов, нитратов проводится общепринятыми методами [1].
В дополнительных исследованиях может использоваться стандартизованная разводящая вода.
Допускается изучение слаборастворимых веществ в смеси с ПАВ или в виде мелкодисперсной взвеси или эмульсии. Контролем при этом служит разводящая вода, содержащая соответствующее количество ПАВ.
7.7. Правильность постановки опыта проверяется по следующим критериям.
7.7.1. Величина БПК за первые сутки должна быть в пределах 0,7—1,2 мг/л, а к концу опыта - не менее 3 мг/л. Динамика процесса БПК выражается зависимостью, близкой к экспоненциальной, не наблюдается смена подъемов и снижений кривой. В двойном логарифмическом масштабе график зависимости представляет собой прямую.
7.7.2. Баланс уменьшения количества аммиачного азота, нарастания и убыли нитритного азота и нарастания азота нитратов (до 0,1 мг/л) должен сохраняться в каждый момент определения.
7.7.3. При длительных исследованиях динамики БПК дополнительная интенсификация процесса на 5—10 или 15 сутки может быть отражением наступления второй стадии минерализации и сопровождаться накоплением нитратов в воде.
7.8. Результаты всех стадий исследований представляются в форме таблиц, а динамика ВПК и динамика развития и отмирания микрофлоры - и в виде графиков.
7.9. При оценке экспериментальных данных выводы делаются на основании каждой серии в отдельности. В силу высокой вариабельности процессов в разных сериях, усреднение и статистическая обработка результатов не допускаются.
7.9.1. Высокая вариабельность процессов самоочищения не позволяет принимать во внимание отклонения от контроля < 15%. С гигиенических позиций процессы ингибирования самоочищения более опасны, чем стимуляция. Поэтому необходима дифференциация критериев вредности в зависимости от направленности нарушения первой стадии минерализации. При ее ингибировании за пороговую принимается концентрация вещества, вызывающая угнетение БПК на 15 %, а при стимуляции - на 20 %. При преимущественном влиянии вещества на вторую стадию минерализации критерием пороговой дозы является 15 %-ное отклонение от контроля.
7.9.2. Если при наименьшей из действующих концентраций БПК отличается от контроля больше или меньше, чем на 15 % (или 20 %), пороговую концентрацию можно рассчитать на основании линейной полулогарифмической зависимости «концентрация-эффект» графическим или статистическим методом и, таким образом, получить более точную величину ПКсан.
7.9.3. Для уточнения величин пороговых концентраций при стимуляции БПК можно определить, сколько в процессе биохимического окисления приходится кислорода на 1 мг изучаемого вещества:
где
А - количество кислорода на 1 мг изучаемого вещества;
БПКх - БПК в опыте, последний срок наблюдения;
БПКк - БПК в контроле в последний срок наблюдения;
С - концентрация изучаемого вещества (мг/л). Правилами охраны поверхностных вод от загрязнения предусмотрено, что в воде водных объектов должен содержаться растворенный кислород в количестве не менее 4—6 мг/л. Поэтому применительно к натурным условиям при благоприятном санитарном режиме водного объекта без заметного ущерба для санитарного состояния водного объекта может быть использовано не более 1— 2 мг/л кислорода. Тогда пороговая концентрация вещества ориентировочно может быть рассчитана по формуле:
где
А - количество кислорода на 1 мг изучаемого вещества.
Поскольку эта формула не в полной мере отражает реальное влияние сточных вод на санитарный режим водных объектов, предложена более точная формула:
где
Q - расход воды водного объекта, м3/с;
q - расход сточных вод, в составе которых сбрасывается нормируемое соединение, м3/с;
а - коэффициент смешения сточных вод с водой водного объекта.
7.9.4. Для расчетного прогноза условий спуска сточных вод, содержащих вещества, нормируемые по общесанитарному признаку вредности и стимулирующие потребление кислорода, важно определение константы скорости потребления кислорода:
где
БПКt и БПК2t - биохимическое потребление кислорода для 2-х сроков инкубации, кратных между собой;
К- искомая константа скорости;
t - время, сут.
8. Установление параметров токсичности веществ
в острых опытах на животных
Установление смертельных эффектов позволяет получить необходимую информацию для решения ряда задач:
• определение параметров токсичности и опасности вещества при однократном (кратковременном) воздействии, а также получение первичной информации о характере и направленности действия;
• сравнительная оценка токсичности нескольких веществ, близких по физико-химическим свойствам или по условиям применения;
• установление видовой, половой и возрастной чувствительности лабораторных животных к действию вредного вещества;
• получение предварительной информации о способности вещества к материальной и/или функциональной кумуляции;
• сравнительная оценка токсичности исходного вещества и продуктов его трансформации в водной среде;
• получение информации, необходимой для выбора доз, исследуемых в подостром и хроническом экспериментах;
• определение правомерности применения корреляционных уравнений количественной зависимости «структура-активность» для прогноза параметров токсикометрии изучаемого вещества;
• установление зависимости «доза-ответ» и расчет средней смертельной дозы DL50.
Доза средняя смертельная - это количество яда, вызывающее гибель 50 % группы подопытных животных за определенный период последующего наблюдения. Поскольку DL50 является статистической величиной, определяются также средняя ошибка и доверительные интервалы.
Другие показатели, например, DL100 (наименьшая доза, вызывающая гибель всех взятых в опыт животных) и DL0 (максимальная переносимая доза) определяются эмпирически, а не статистически, и поэтому могут использоваться как дополнительные ориентировочные величины.
8.1. Вещество изучается при следующих путях поступления в организм: при введении в желудок, нанесении на кожу.
Токсичность при внутрижелудочном введении определяется в опытах на животных (белых мышах массой 18—24 г, белых крысах массой 180—240 г, половозрелых морских свинках массой 350— 500 г, кроликах массой 1,5—3,0 кг).
8.2. Выбор доз для исследования осуществляется:
• по аналогии с данными о токсичности близких по структуре веществ;
• расчетным путем по математическим моделям;
• в ориентировочном эксперименте.
В ориентировочном эксперименте устанавливается зона смертельного действия - отношение абсолютной смертельной дозы к минимальной смертельной или максимальной переносимой. Затем выбирается ряд доз, например, в соответствии с рядами Фульда:
1,0; 1,3; 1,8; 2,4; 3,2; 4,2; 5,6; 7,5; 10,0; 13,0
1,0; 1,3; 1,7; 2,1; 2,8; 3,6; 4,6; 6,0; 7,7; 10,0; 13,0
1,0; 1,3; 1,6; 2,0; 2,5; 3,2; 4,0; 5,0; 6,3; 8,0; 10,0
Ориентировочная DL50 может быть установлена методом одной-двух точек или путем испытания ряда последовательных доз на 1—2 подопытных животных.
8.3. Количество животных в развернутом опыте должно быть достаточным для статистических расчетов. Каждая доза испытывается не менее, чем на 10 белых мышах, белых крысах, на 6 морских свинках, кроликах и других животных.
8.3.1. Вещество в каждой из выбранных доз (а для соединений 3 и 4 классов стабильности и ранее не нормированные продукты трансформации) вводится с помощью зонда однократно в водном растворе, при малой растворимости в воде - в растительном масле. Может быть применен «универсальный» растворитель - диметилсульфоксид. Труднорастворимые, вязкие, смоло-, порошкообразные вещества можно вводить в виде взвесей или эмульсии в яичном желтке, 1—2%-ном растворе крахмала, с добавлением нетоксичных поверхностно-активных веществ. В отдельных случаях допустимо использование других растворителей: этанола, глицерина, полипропиленгликоля и т.п. Обязательное условие - введение контрольным животным используемого растворителя в эквивалентных количествах.
8.3.2. Для создания необходимых доз предпочтительнее вводить разные объемы раствора вещества одной концентрации. Вместе с тем, объем водных растворов не должен превышать 1—1,5 %, а масляных - 0,5—1 % от веса тела. Вещество вводится через 2—3 часа после кормления. Через 3—4 часа после введения вещества допускается очередное кормление животных.
8.3.3. Максимальная вводимая доза в желудок - 10 г/кг. При испытании малотоксичных веществ, не приводящих к гибели при однократном введении, допустимо вводить вещество несколько раз в максимально возможной концентрации в объеме ?? 5 %, а масляные растворы до 2 % от веса тела с интервалом между введениями не менее 1,5 часов. Следует учитывать и предотвращать возможное местное раздражающее действие веществ, испытывать нейтрализованные растворы при условии, что это не приведет к разрушению и трансформации структурной части молекулы, определяющей токсичность вещества.
8.4. Наблюдение за животными продолжается в течение 14 дней после введения вещества. Фиксируется время гибели каждого животного (в первые сутки - в часах), общее количество погибших. Результаты заносятся в таблицу (табл. 8.1). Подробно описывается клиническая картина отравления, желательно - морфологические изменения внутренних органов и тканей. Делаются предварительные выводы о характере токсического действия вещества.
Таблица 8.1
Динамика гибели животных после однократного введения
вещества в различных дозах
|
Дозы, мг/кг |
Число животных в |
Число погибших животных по срокам наблюдения в часах (сутках) |
Общее число погибших |
% гибели |
|||
|
|
группе |
|
|
|
|
животных |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
8.5. Токсичность при накожном нанесении изучается согласно [1].
8.6. Расчет DL50 и доверительного интервала может проводиться любым из статистических методов, т. к. различия между величинами по результатам расчета значительно меньше, чем по экспериментальным данным, полученным в разных условиях. Более точным считается метод Литчфилда-Уилкоксона.
8.7. Для веществ из малоизученных классов необходимо определять сравнительную половую и видовую чувствительность на 4-х видах лабораторных животных, для остальных веществ - на 2-х видах. Определение острой токсичности на морских свинках, кроликах, кошках (в особых случаях) допустимо методом 1—2 точек. Метод дает возможность рассчитать ошибку и доверительные интервалы величин DL50.
8.8. Для получения сопоставимых результатов целесообразно стандартизовать условия эксперимента по виду, полу, возрасту, условиям содержания животных. С другой стороны, не следует чрезмерно уточнять их путем увеличения числа животных, уменьшения шага между дозами, усложнения методов расчета.
8.9. При оценке результатов острых опытов могут использоваться классификации токсичности, представленные в таблице 8.2.
Кроме того, необходим анализ кривых «доза-ответ», которые могут соответствовать не только функции нормального распределения, но и гиперболе, параболе, экспоненциальной кривой. Угол наклона кривых к оси абсцисс может дать информацию об общности или, наоборот, резких различиях в механизме токсического действия ряда веществ или на различные виды животных.
Пологая кривая чаще всего свидетельствует о плохом всасывании, быстром выведении или трансформации, или о наличии резких различий в индивидуальной чувствительности. Выраженная крутизна наклона свидетельствует об активном всасывании, быстром развитии токсического эффекта, а также о незначительных различиях в индивидуальной чувствительности.
Таблица 8.2
Классификация токсичности по смертельным эффектам
