---

В случае полуколичественных методов результаты подсчета в последовательных секторах чашки с инокуляцией экометрическим методом суммируются для получения показателя роста G_h который варьиру­ется в зависимости от культуральной среды. Таким образом, является существенным их сравнение с пре­дыдущими показателями и/или с G, эталонной среды и необходимо убедиться, что имеющиеся вариации не превышают норму. Ожидаемый диапазон вариаций для каждой культуральной среды также может быть установлен, как только будет наработан достаточный опыт в использовании метода.

Качественные определения проводят визуально путем локализации баллов, характеризующих рост.

Для количественной оценки селективности селективные культуральные среды и эталонную среду инокулируют с использованием надлежащего инокулята (см. 4.2.1.2) определенного тест-микроорганизма при помощи надлежащего устройства. Селективность должна достичь определенныхзначений (см. соот­ветствующий конкретный стандарт или приложение В).

Фактор селективности S_F вычисляют по формуле

S

(2)

_F - D_o— D_s,

где D_o— наибольшее разбавление, при котором отмечается рост по меньшей мере 10 колоний на эталон­ной среде;

D_s— наибольшее разбавление, демонстрирующее сопоставимый рост на испытуемой среде.

S_F, D_oи D_s выражены в единицах 1од₁₀.

Примечание — S_F нецелевых микроорганизмов на селективной среде должен быть не менее двух. Это значение, как правило, достигается. Вместе с тем, для определенных комбинаций сред и тест-микроорга- низмов могут быть приняты менее жесткие критерии (см. соответствующий стандарт или приложение В).

Для полуколичественных и качественных методов рост неселективного штамма(ов) должен быть час­тично или полностью ингибирован.

Чтобы получить полную картину характеристик сред, необходимо определить морфологию колоний и диагностические особенности, а также степень селективности.

Должны быть определены и достигнуты существенные характеристики специфичности. Для диффе­ренциальных сред должны быть определены качественно биохимические/физиологические характеристики целевых микроорганизмов и степень ингибирования нецелевых микроорганизмов следует определить с использованием надлежащего набора испытательных штаммов.

Антимикробное действие антибиотиков зависит от характеристик их диффузии в агаре и любых антаго­нистических влияний присутствующих компонентов. Среды для испытаний присутствия или отсутствия ан­тимикробных веществ в пробах пищевых продуктов должны соответствовать эталонным методам.

4.3 Оценка характеристик и интерпретация результатов

Партия культуральной среды демонстрирует удовлетворительные эксплуатационные характеристики, если все используемые тест-микроорганизмы ведут себя в соответствии с признаками, приведенными в настоящем стандарте. Партия должна быть принята в случае, если соблюдаются общие и микробиологи­ческие критерии качества.

5 Методы проверки характеристик питательных сред

Описаны примеры количественного, полуколичественного и качественного методов испытаний для твердых культуральных и жидких сред. В большинстве случаев полуколичественный и качественный мето­ды, используемые в лаборатории пользователя, должны соответствовать требованиям проверки характери­стик партии питательной среды.

В особых случаях, например при оценивании новой среды или нового производителя и т. п., количе­ственные методы испытаний следует применять в лаборатории пользователя.

Предполагается, что общепринятые микробиологические методы известны и, следовательно, их пол­ное изложение не приводится.

Релевантные тест-микроорганизмы приведены в приложении В (см. также ISO 11133-1).

Примечание — В новые и пересматриваемые стандарты по определению или подсчету конкретных микроорганизмов или групп микроорганизмов следует включать описание релевантных тест-микроорганизмов, которые будут использоваться вместе с критериями приемлемости для каждой культуры в стандарте.

Для жидких сред взаимодействия, приводящие к успешному росту микроорганизмов, более слож­ные; таким образом, устанавливаемые методы эксплуатационных испытаний менее эффективны, чем для твердых сред.

Для успешной изоляции целевых микроорганизмов в многостадийном методе, например определе­нии Salmonella, на каждой стадии роста имеют место несколько сложных взаимодействий. В данном слу­чае следует провести контрольное испытание с использованием надлежащих проб, культуры и эталонных веществ, чтобы продемонстрировать продуктивность или соответственно селективность всего метода. Кро­ме того, можно продемонстрировать, что каждый компонент среды соответствует целям.

Релевантные эталонные штаммы целевых (продуктивность) и нецелевых (селективность) микроорга­низмов для каждой культуральной среды приведены в приложении В. Тест-микроорганизмы должны соот­ветствовать требованиям, изложенным в ISO 11133-1 (пункт 5.2.2), например, речь идет о жизнестойких, медленно растущих, биохимически неактивных или поврежденных штаммах, когда это целесообразно.

Методические указания по консервированию и сохранению эталонных штаммов приводятся в прило­жении В.

Рабочие культуры следует готовить в виде чистой культуры в стационарной фазе роста в неселектив­ном бульоне из эталонных исходных культур.

Могут использоваться различные методы, но они должны гарантировать чистоту инокулята, а также его -е стандартность, которая позволит использовать его в последующей стадии.

Примечание — Замороженные инокуляты можно использовать, если будет показано, что данный микроорганизм способен выживать в течение выбранного периода.

Для количественных испытаний чашечной среды для требуемых микроорганизмов используется ино­кулят, содержащий приблизительно 10² КОЕ.

Для полуколичественныхили качественных испытаний чашечной среды необходим инокулят, содер­жащий 10³—10⁴ КОЕ.

Для испытаний на продуктивность жидких сред используется инокулят, содержащий 10—100 КОЕ.

Для испытаний культуральных сред на селективность в чашку или в пробирку со средой инокулируют суспензию нецелевых микроорганизмов, содержащую от 10⁴ до 10⁶ КОЕ.

Инокулированные культуральные среды инкубируют с соблюдением условий, описанных в соответ­ствующем стандарте и приведенных в соответствующих таблицах приложения В.

Это обычный метод, пригодный для большинства плотных культуральных сред. Он может быть непри­годным для испытаний некоторых видов плесневых грибов.

Используют рабочие культуры в соответствии с 5.2.1.

Отбирают соответствующее число чашек, которое является представительными для каждой партии, подлежащей испытаниям, и обеспечивают правильное высушивание поверхности каждой чашки. Чашки с эталонной средой готовят аналогичным образом.

По поверхности испытуемых и эталонныхчашек распределяют инокулят разбавленной рабочей куль­туры с целью внесения количества, которое входит в рекомендуемые пределы, приведенные в 5.2.1.

Примечания — Может также использоваться чашечный метод для культуральных сред, обычно применяемых для подсчета таким образом.

Чашки инкубируют в соответствующих условиях, как это установлено в соответствующих стан- да ртах.

Проводят подсчет колоний, присутствующих в каждой чашке или в каждой капле, по обстоятель­ствам. Оценивают размер и внешний вид колоний.

Исходя из объема, распределенного на чашках, и фактора разбавления можно рассчитать среднее количество микроорганизмов в среде. В случае использования капельных методов необходимо принимать во внимание количество капель и их объем.

Для интерпретации результатов следует рассчитать коэффициент производительности P_R (см. 5.2.3.2) или фактор селективности S_F (см. 5.2.3.3).

Метод посева штрихом пригоден для определения рабочиххарактеристик плотных и жидких культу­ральных сред, данный метод является только полуколичественным. Таким образом, показатели роста явля­ются лишь ориентировочными, и он может рассматриваться только как дополнительное испытание твердых культуральных сред.

При использовании данного метода испытуемые культуральные среды необходимо высушить до од­ной и той же степени, и вся процедура должна быть стандартизирована, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные для различных партий.

Чашки с агаром готовят обычным способом, используя около 15 см³ агара. Среды, обычно использу­емые в чашечном методе, например агар для чашечного подсчета, могут также подвергаться испытаниям поверхностным культивированием на затвердевших средах.

Используют рабочие культуры, как это описано в 5.2.1.

В чашки делают посев штрихом, как это показано на рисунке 1, используя петлю на 1 мкл. Проводят четыре параллельные линии петлей с интервалом приблизительно 0,5 см в секторе А. Штриховую разводку повторяют для секторов В и С и завершают в секторе D одной линией. Для помощи в выполнении точного посева штрихом под чашкой можно использовать шаблон.

Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.

Примечание— В культуру необходимо погружать только петлю, но не проволоку. Петля должна быть полностью заполнена культурой. Избыточную жидкость удаляют трехкратным нажатием на расширен­ную часть петли, используя край емкости. При посеве штрихом угол между петлей и поверхностью агара должен быть от 20° до 30°. Давление петли на поверхность агара и скорость посева штрихом должны быть всегда соразмерны. Следует избегать погружения петли в культуру, если на поверхности бульона имеются пена и/или пузыри.

Обычно для посева штрихом всех секторов от А до D используют одну и ту же петлю без обработки в пламени между операциями посева штрихом. В некоторых случаях, когда более низкий показатель роста

G/, как ожидается, должен продемонстрировать четко выраженные различия, может быть уместной замена или стерилизация петли между операциями посева штрихом в секторах А и В.

Рисунок 1 — Образец проведения инокуляции при помощи модифицированного метода посева штрихом и угол наклона петли

После инкубации оценивают внешний вид, размер колоний и интенсивность роста и вычисляют пока­затель роста G/. Каждой линии посева, которая показывает рост, приписывают 1 балл. Максимальное коли­чество баллов для чашки равно 16. Линии приписывают 0,5 баллов, если рост наблюдается только на половине ее длины. Линия, на которой роста нет или имеется ограниченный рост (менее половины длины), оценивается в 0 баллов. Баллы суммируют с целью получения G_;. Например, если рост наблюдается в секторах А и В и в половине сектора С, G_; будет равен 10.

Показатель роста G_h характеризующий целевой штамм, должен быть по меньшей мере равен 6, чтобы сделать выводы о приемлемости среды. В случае неселективных сред G_t обычно выше.

Кроме того, рост целевого штамма должен быть типичным, а рост нецелевых штаммов должен быть частично или полностью ингибирован.

Данный метод пригоден для дополнительных эксплуатационных испытаний твердых культуральных сред.

Данный метод является только качественным, и, таким образом, оценка дается только приблизи­тельная.

Чашки с агаром готовят обычным способом, используя около 15 см³ агара. Среды, обычно использу­емые в чашечном методе, например агар для чашечного подсчета, могут также подвергаться испытаниям поверхностным культивированием на затвердевших средах.

Используют рабочие культуры, как это описано в 5.2.1.

Тест-микроорганизмы наносят прямыми параллельными линиями, используя петлю на 1 мкл, на по­верхность испытуемой среды. В одной и той же чашке можно осуществлять посев штрихом нескольких тест-микроорганизмов, не смешивая их.

Примечание — Возможно применение других стандартизированных методов посева штрихом.

Рост, наблюдаемый в чашках после инкубации, оценивается следующим образом:

• 0 соответствует нулевому росту,1 соответствует слабому росту и

• 2 соответствует значительному росту.