При анализе фитопланктона, богатого зелеными и сине-зелеными водорослями с толстыми оболочками или слизью, для повышения полноты гомогенизации при растирании допускается добавить кварцевый песок или толченое стекло марки «пирекс».
Взвесь, осажденную на фильтр из стекловолокна, допускается гомогенизировать вместе с фильтром. В этом случае следует использовать гомогенизатор со сферическими рабочими поверхностями.
Кроме механического растирания, допускаются другие способы гомогенизации, например с помощью ультразвука. При этом способе необходимо следить за отсутствием чрезмерного, выше 40 °С, нагрева обрабатываемой взвеси.
Высокая степень гомогенизации достигается также продавливанием замороженной взвеси под большим давлением через узкое отверстие (фильеру).
Центрифугирование. Светорассеивающую взвесь удаляют из экстракта центрифугированием при 4000—5000 g в течение 15 мин, например на центрифуге типа ЦЛН-2 при 8000 об/мин. Чистота экстракта контролируется по оптической плотности на 750 нм. Последняя не должна превышать 0,005Б на каждый сантиметр рабочей длины кюветы. При более высокой плотности центрифугирование следует повторить.
После центрифугирования экстракт следует перенести в стеклянную мерную пробирку, при необходимости, добавляя 90 %-ный ацетон, довести его объем до объема фотометрической кюветы и закрыть пробирку притертой пробкой (см. приложение 2, табл. 5).
Подготовленный к фотометрированию экстракт допускается хранить в холодильнике при температуре 0—5 °С не более 1 сут.
Спектрофотометрирование и подкисление экстракта. При спектрофотометрировании используются кюветы с рабочей длиной от 0,5 до 5 см в зависимости от объема экстракта и его оптической плотности. Последняя должна находиться в диапазоне 0,05—0,8Б.
Отсчеты оптических плотностей берутся на четырех длинах волн — 664, 647, 630 и 750 нм. Фотометрирование проводится дважды: до и после подкисления экстракта несколькими каплями приготовленного раствора соляной кислоты в ацетоне.
Количество кислоты, добавляемой в экстракт, зависит от его объема и рассчитывается таким образом, чтобы концентрация кислоты в нем равнялась 3—5 ммоль дм-3. Такая концентрация будет получена, если к каждому кубическому сантиметру экстракта добавить 0,01 см3 приготовленного заранее раствора НС1 (см. п. 6.4). После добавления кислоты экстракт необходимо перемешать в течение 2—3 мин.
При фотометрировании подкисленного экстракта отсчеты берутся на двух длинах волн 664 и 750 нм.
Одновременно с определением концентрации хлорофилла а допускается определять концентрации и других пигментов: феофитина а, хлорофиллов b и Cj+cj, суммарную концентрацию каротиноидов, а также пигментный индекс (см. п. 9.3). С этой целью необходимо до подкисления экстракта дополнительно взять отсчеты еще на двух длинах волн — 430 и 480 нм.
ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Концентрацию хлорофилла а в пробе (сха), вычисляют по формуле
=
(1)
э44£l64_- Д664^-5^ п еХЗ »
^664
к
где Dgg4 и D 664 — оптические плотности экстракта в белах на длине волны 664 нм до и после его подкисления. Концентрации хлорофилла а в пробе, мкг-дм-3, без поправки на присутствие феофитина а (с ’ха) вычисляют по формуле
с 'ха = (11,857)664 - 1 >547)647 ~ 0,087)630) w
пр
где 7)6зо и Т)б47 — оптические плотности экстракта в белах на длинах волн 630 и 647 нм;
V3 — объем экстракта, см3;
Упр— объем пробы, дм3;
/ — длина кюветы, см.
Концентрации других пигментов (Сфа, сь, с ск), мкгдм-3, рассчитывают по формулам
2
(3)
(5)
11 l,77)L-7)66 .Я 664
с ь= (21,03 7)647 - 5,43 7)664 - 2,66Т)630) •
сci+ c2- (24,527)630 — 1,677)664 — 7,6Т)647) • у~~
В том случае, если в пробе содержатся преимущественно зеленые или сине-зеленые водоросли, то концентрации каротиноидов (ск), мкг-дм-3, вычисляют по формуле
При доминировании диатомовых, перидиней, золотистых и разножгутиковых — по формуле
^= 107)480--^- (7)
пр
Пигментный индекс в экстракте вычисляют по формуле
, _ D 430 (8)
430/664
Все оптические плотности, входящие в формулы (1) — (8), берутся с учетом поправки, которая равна оптической плотности на длине волны 750 нм. Эта поправка вычитается из значения измеренной оптической плотности.
За результат определений принимают единичный результат для каждой пробы.
ПОГРЕШНОСТЬ определений
При соблюдении требований, предусмотренных данным стандартом, погрешность текущих определений хлорофилла а±8г в процентах не будет превышать значений, указанных в табл. 1.
Таблица 1
|
Концентрация хлорофилла а в пробе воды, мкгдм-3 |
Ориентировочная концентрация хлорофилла а в экстракте, мкг • см-3 |
Погрешность ±6^ % |
|
<0,02 |
<0,25 |
100 |
|
0,02-0,07 |
0,25-0,5 |
50 |
|
0,07-0,2 |
0,5 -1,5 |
30 |
|
0,2 -0,7 |
1,5 -2,5 |
20 |
|
>0,7 |
>2,5 |
10 |
РЕГУЛЯРНЫЙ КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ТЕКУЩИХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
Строгое соблюдение требований настоящего стандарта обеспечивает исключение всех составляющих погрешности, кроме тех, которые возникают при фотометрировании экстракта. Поэтому для обеспечения текущих определений с регламентированной погрешностью наряду с соблюдением требований, установленных методикой, следует регулярно контролировать погрешность, возникающую при спектрофотометрировании.
С этой целью в соответствии с требованиями ГОСТ 8.513 необходимо ежегодно проводить обязательную государственную поверку спектрофотометра. Кроме того, перед каждой серией текущих определений, но не реже одного раза в месяц следует оценивать погрешность определений оптической плотности и установки шкалы длин волн путем сравнения спектров контрольных светофильтров, входящих в комплект прибора, с их спектрами, указанными в паспорте.
ТРЕБОВАНИЯ К ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ОТХОДОВ АНАЛИЗА,
К БЕЗОПАСНОСТИ И КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА
Слив отходов анализа в канализацию допускается после их предварительного разбавления не менее чем в 100 раз.
В процессе анализа требуется соблюдение мер предосторожности, регламентируемых при работе с вредными веществами (для ацетона, соляной кислоты и углекислого бария) по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.
Лица, допускаемые к выполнению измерений, должны обладать опытом проведения типовых биохимических анализов, а также навыками обращения со спектрофотометрами.
ФОРМА ОТЧЕТА О ПРОВЕДЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ
В отчете должна быть следующая информация:
место, время и устройство отбора проб;
результаты должны быть выражены в соответствии с разд. 9;
любые отклонения от данной методики и другие обстоятельства, которые могут повлиять на результаты определений;
ссылка на настоящий стандарт.ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Справочное
БАТОМЕТРЫ И ФИЛЬТРЫ
Устройства для отбора проб
Устройствами для отбора проб могут служить:
батометр, срабатывающий от посыльного грузика или электрического импульса на заданной глубине;
батометр для отбора «интегральной» пробы, снабженный устройством для обеспечения равномерного поступления воды при равномерном движении батометра в слое отбора;
шланг (с насосом или без насоса);
ведро (для отбора проб с поверхности).
Материал для изготовления рабочих емкостей устройств для отбора, с которыми непосредственно контактирует отобранная проба, должен быть непрозрачным, нетоксичным, коррозийно-стойким. Оптимально удовлетворяет этим требованиям черный полиэтилен. Для батометра допускается винипласт, оргстекло, другие пластмассы, стекло. При этом прозрачные материалы должны иметь снаружи непрозрачное покрытие. Перед началом работ устройство для отбора необходимо в течение нескольких дней выдержать в воде и тщательно отмыть.
Для изготовления батометров можно воспользоваться конструкторскими разработками, осуществленными в ОКБ океанологической техники института океанологии АН СССР (см. табл. 2). Вместимость и марки батометров указаны в табл. 2.
Таблица 2
|
Вместимость батометра, дм3 |
Марка батометра по спецификации ОКБ ОТ ИОАН СССР |
Вместимость батометра, дм3 |
Марка батометра по спецификации ОКБ ОТ ИОАН СССР |
|
1 |
БП-1-63 |
10 |
БМ10—00—00 |
|
2,5 |
ОА-07.00.00.00 |
30 |
БМ,0-00-00 |
|
2,5 |
2БМ, ,-00-00 |
130 |
2А.011.00.00.00 |
|
7 |
Б4-С7-65 |
150 |
0А.285.00.00.00 |
Кроме того, выпускается «барометр морской» вместимостью 1 дм3 марки БМ-48.
Для защиты этих батометров от коррозии рекомендуется двухразовое покрытие их внутренней поверхности лаком марки ЭДН-1 по нормативно-технической документации или аналогичным.
Размеры мембранных фильтров отечественного производства (мембраны «ВЛАДИПОР» типа МФА- МА ПО «ТАСМА») указаны в табл. 3.
Таблица 3
|
Диаметр диска, мм |
Минимальный объем партии, шт. |
Диаметр диска, мм |
Минимальный объем партии, шт. |
|
35-г 47_2 |
10000 6000 |
90_3 142_4 |
1500 500 |
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Справочное
Черт. 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЪЕМОВ ПРОБ
Ориентировочно оценить объем пробы при заданной величине ожидаемой концентрации хлорофилла а в пробе, можно по табл. 4.
Таблица 4
|
Концентрация хлорофилла а в пробе мгм-3 |
0,05 |
0,1 |
0,5 |
1 |
5 |
10 |
50 |
100 |
|
Объем пробы, дм123 |
Более 40 |
20-50 и более |
5-50 |
2-20 |
0,4-4 |
0,2-2 |
0,04-0,4 |
0,02-0,2 |
Примечание. Приведенные объемы проб рассчитаны, исходя из оптимального диапазона оптических плотностей экстракта на длине волны 664 нм (0,05—0,8 Б) и характерного отношения объема к рабочей длине для кювет, обычно используемых при фотометрировании. Это отношение может меняться от 2,5 до 4. При использовании специальных кювет с меньшим отношением объема к длине объем проб следует уменьшить пропорционально уменьшению указанного отношения. Ориентировочные соотношения между количеством хлорофилла а в экстракте, длиной кюветы (/), объемом экстракта в кювете (Иэ), концентрацией хлорофилла а в экстракте (схо) и оптической плотностью Z>664 приведены в табл. 5.
Таблица 5
|
Количество хлорофилла а в экстракте, мкг |
2 |
5 |
10 |
20 |
||||||||||||
|
/, см |
1 |
2 |
5 |
1 |
2 |
5 |
1 |
2 |
5 |
1 |
2 |
5 |
||||
|
И,, см3 |
4 |
8 |
20 |
4 |
8 |
20 |
4 |
8 |
20 |
4 |
8 |
20 |
||||
|
мкгсм-3 |
0,5 |
0,25 |
0,1 |
1,25 |
0,625 |
0,25 |
2,5 |
1,25 |
0,5 |
5 |
2,5 |
1 |
||||
|
■°664, Б |
0,05 |
0,125 |
0,25 |
0,5 |
||||||||||||
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Рекомендуемое
Схема фильтровальной установки для фильтрования самотеком в полевых условиях
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Рекомендуемое
Схема установки для получения сжатого воздуха, используемого при завершении фильтрования самотеком
или при фильтровании проб малого объема в полевых условиях
1 — сжатый воздух; 2 — пробка; 3 — канистра; 4 — вода;
5 — трубка; 6 — зажим; 7 — анализируемая проба; 8 — воронка фильтровальная
Черт. 2
Примечания:
Предпочтительнее использовать дюралевые канистры, однако, при небольшом давлении (до 0,15— 0,2 атм) пригодны канистры из твердого полиэтилена.
Для получения запаса сжатого воздуха в нижней канистре следует:
собрать установку по схеме, изображенной на черт. 2, заполнить верхнюю канистру водой до уровня, не доходящего до пробки на несколько сантиметров;
разжать верхний зажим и зажать нижний;
наклонить верхнюю канистру так, чтобы вода начала поступать по трубке в нижнюю, после чего возвратить ее в нормальное положение;
после перетекания воды в нижнюю канистру в ней образуется запас сжатого воздуха, давление в котором будет определяться разностью уровней воды в канистрах — Н.
