Среду Рогоза агаризованную готовят по рецептуре, описанной в п. 3.2.12, с добавлением 20,0 г агара. После растворения*. С* 7 ГОСТ 10444*11—89
Р - •
; компонентов среду разливают в стерилыные колбы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121± 1) °С в течение 15 мин. Готовую среду хранят при температуре (4± 1) °<3 не более 30 сут.
Среду из томатного сока готовят по ГОСТ 10444.1.
Среда для определения псевдокаталазы: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 5,0 пептона, 25 см3 дрожжевого экстракта, 0,5 см3 твина — 80, 0,1 г (M.nSO4-4H2O), 0,5 г глюкозы, 15 г агара доливают мясо-пептонным бульоном до метки, растворяют компоненты нагреванием на водяной бане и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С (6,9±0,1). Среду разливают в пробирки по 5—7 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 мин. После стерилизации пробирки укладывают на наклонную поверхность для получения косяков*
Среда Lee:
основа среды — в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 10,0 г пептона, 50 см3 дрожжевого экстракта, 5,0 г лактозы, 3,0 г углекислого кальция, простерилизованного по ГОСТ 10444.1, 0,5 г Na2HPO4, 18 г агара, доливают дистиллированной водой до метки, растворяют компоненты нагреванием на водяной бане и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С (7,0±1). Среду стерилизуют в автоклаве при тем- пературе (121 ±1) °С в течение 20 мин и, при необходимости, хранят при температуре (4± 1) °С не более 30 сут.
Для приготовления питательной среды к 1 дм8 основы добавляют 20 см3 стерильного раствора бромкрезолового пурпурного с массовой концентрацией 1 г/дм3, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среду хранят при температуре (4 ± 1) °С не более 7 сут.
3 3 р|риготовление ПИТательных сред для испытания кисломолочных продуктов, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочно-кислых бактерии
Приготовление гидролизованного молока
Натуральное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят или обрабатывают текучим паром в течение 20 мин и охлаждают до температуры (45±2) °С. Доводят активную кислотность до pH (7,7±0,1), добавляя водный раствор с массовой долей NaOH 40%. К 1000 см3 молока добавляют от 0,5 до 1,0 г порошка панкреатина. Затем к молоку добавляют от 5 до 6 см3 хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при температуре (40±2) °С в течение 18—24 ч. В течение первых 3—5 ч молоко 2—3 раза перемешивают (пробку после перемешивания - приоткрывают для удаления хлороформа). і
Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажным фильтр, разводят дистиллированной водой в соотношении 1 : устанавливают активную кислотность pH (7,1 ±0,1), добавляя вод- 1 сл
ГОСТ 10444,11-89 С. 8
ный раствор с массовой долей NaOH 40% и используют для приготовления агара с гидролизованным молоком. В случае хранения гидролизованное молоко стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С в течение 15 мин,
Приготовление агара с гидролизованным молоком
Состав:
гидролизованное молоко, см3 — 1000;
агар, г — 15.
К 1000 см3 гидролизованного молока прибавляют 15 г агара. Среду нагревают до полного расплавления агара и фильтруют через вату, разливают в пробирки, или колбы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение (10± 1) мин.
Приготовление стерильного обезжиренного молока
Натуральное или восстановленное обезжиренное молоко разливают по 10 см3 в пробирки и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (10±1) мин.
ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ
Проведение испытания пищевых продуктов (кроме кисломолочных продуктов, з аквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочно-кислых бактерий)
Для определения микроорганизмов используют подготовленную пробу продукта или его исходное разведение.
Для определения присутствия и подсчета количества микроорганизмов на чашках Петри из пробы пищевого продукта или из исходного разведения готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством микроорганизмов, указанным в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.
Для подсчета НВЧ из пробы пищевого продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений таким образом, чтобы в посевах наибольшего разведения микроорганизмы не были обнаружены. Для посева выбирают не менее трех последовательных раз- ведений. Из каждого разведения засевают три параллельные пробирки.
Для посева в жидкие среды по методу НВЧ и на чашки Петри глубинным методом отбирают по 1,0 см3 подготовленной пробы продукта и (или) его разведения для посева на чашки Петри поверхностный методом — по 0,1—0,2 см3.
Посевы глубинным или поверхностным методами, а также с применением мембранной фильтрации проводят по ГОСТ 26670.
При применении метода мембранных фильтров фильтруют объем жидкого продукта, который указан в нормативно-технической документации на конкретный вил пищевого продукта.
12
1■С. 9 ГОСТ 10444.11—80
Для определения присутствия или подсчета НВЧ молочно-кислых микроорганизмов проводят посев на одну из жидких сред, указанных в пп. 3.2.2, 3.2.6 или 3.2.12.
Если после внесения продукта в среду Бликфельдта среда изменит іивет, то в нее добавляют несколько капель раствора стерильной щелочи (NaOH или КОН) массовой концентрацией 50 г/дм3 до восстановления первоначальной окраски.
Для определения присутствия или подсчета количества молочно-кислых микроорганизмов допускается взамен посева в жидкие среды проводить посев глубинным методом в одну из агаризован- ных сред, указанных в пп. 3.2.1, 3.2.5, 3.2.7, 3.2.13 или 3.2.14.
Для определения присутствия или подсчета НВЧ бактерий рода Lactobacillus проводят посев на одну из жидких сред, указанных в пп. 3.2.6 или 3.2.12.
Для определения присутствия или подсчета количества бактерий рода Lactobacillus взамен посева в жидкие среды проводят посев глубинным методом в одну из агаризованных сред, указанных в пп. 3.2.7 или 3.2.13.
Для определения присутствия бактерий рода Leuconostoc проводят посев на жидкую среду, указанную в п. 3.2.4.
Для определения присутствия взамен использования жидкой среды, а также для подсчета количества бактерий рода Leuconostoc на чашках Петри или с применением метода мембранной фильтрации проводят посев поверхностным методом на агаризо- ванную среду, указанную в п. 3.2.10.
Для определения присутствия или подсчета количества стрептококков группы N рода Streptococcus проводят посев глубинным методом в агаризованную среду, указанную в п. 3.2.11, а для S. thermophilus используют среду по п. 3.2.16.
Для определения присутствия или подсчета количества бактерий рода Pediococcus проводят посев глубинным методом в агаризованную среду, указанную в п. 3.2.3.
Посевы для определения присутствия или подсчета количества молочно-кислых микроорганизмов, бактерий родов Lactobacillus стрептококков группы N рода Streptococcus инкубируют не более 5 сут при температуре (30± 1) °С или не более 3 сут при температуре (37±1)°С; посевы для определения присутствия или подсчета количества бактерий рода Leuconostos инкубируют не более 5 сут при температуре (22±1)°С. Посевы для определения присутствия или подсчета количества S. thermophilus инкубируют (48±3) ч при ^температуре (45±1)°С. Посевы на чашках Петри для определения присутствия или подсчета количества бактерий рода Leuconostoc инкубируют дном вниз.
Инкубирование посевов на жидких средах прекращают при появлении видимых признаков роста.
ГОСТ 10444.11—80 С. 10
Предварительный подсчет колоний на агаризованных средах проводят через 48 ч.
В посевах на агаризованных средах для определения присутствия или подсчета количества молочно-кислых микроорга' и из мов, бактерий рода Lactobacillus, Pediococcus стрептококков группы N рода Streptococcus, S. thermophilus, ограничение доступа кислорода осуществляют по ГОСТ 10444.4 или одним из указанных ниже способов:
на застывшую питательную среду в чашках Петри наливают второй слой расплавленной и охлажденной до (45±1)°С агари- зованной среды в количестве 5,0 см3 и оставляют до затвердения;
чашки Петри помещают в газовую среду, состоящую из 95% N2 и 5% СО2;
чашки Петри помещают в анаэростат. Аппарат закрывают, с помощью вакуумного насоса создают вакуум 86,6—93,3 кПа;
в каждую пробирку с жидкой средой добавляют стерильный жидкий парафин в количестве, необходимом для получения столба высотой около 2 см.
Посевы на жидких средах ежедневно просматривают и отбирают пробирки с видимыми признаками роста. Характер роста на жидких средах приведен в приложении 2. Из пробирок с признаками роста проводят пересев на агаризованные среды (см. п. 4.1.3) бактериологической петлей так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют по п. 4.1.4.
Посевы на агаризованных средах после инкубирования просматривают и для подсчета отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний.
При определении количества микроорганизмов методом мембранных фильтров допускается проводить отбор чашек Петри для подсчета, если на фильтрах выросло менее 15 характерных колоний.
Характеристика характерных колоний приведена в приложении 2.
Для подтверждения принадлежности характерных колоний к молочно-кислым микроорганизмам или бактериям одного из родов Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, стрептококкам группы N рода Streptococcus или S.thermophilus отбирают из посевов по п. 4.L7 или 4.L6 не менее 5 характерных колоний. Принадлежность каждой ^тобранной колонии к определенным микроорганизмам устанавливают по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы, дополнительно при идентификации бактерий рода Leuconostoc определяют наличие капсул, при идентификации стрептококков вида S. thermophilus и стрептококков группы N рода Streptococcus — наличие роста в мясопеп-С її ГОСТ 10444.11—8#
тонном бульоне с pH 9,6, и в мясопептонном бульоне с 6,5 % NaCl,
Для определения отношения микроорганизмов к окраске по Граму из колоний приготавливают мазки, окрашивают их по ГОСТ 10444.3 и микроскопируют.
Для изучения подвижности микроорганизмов из колоний приготавливают препараты методом висячей или раздавленной капли и микроскопируют, Результаты микроскопирования оценивают в соответствии с приложением 1.
Каталазную активность культур определяют по ГОСТ 10444.3.
Результаты определения каталазной активности оценивают в соответствии с приложением 1.
Разложение перекиси водорода у бактерий рода Pediococcus возможно за счет фермента псевдокаталазы, Поэтому при определении молочно-кислых микроорганизмов или бактерий рода Pedio- coccus в случае, если в характерных колониях обнаружены грам- положительные, неподвижные микроорганизмы, дающие положительную каталазную реакцию, контролируют отсутствие цитохромов путем постановки бензидинового теста. Для этого выросшие на чашках Петри колонии бактерий 24—48-часового возраста заливают раствором бензидина, указанным в п. 3.1.9. После того, как раствор пропитает колонии, прибавляют в чашку приблизительно такой же объем 5 % -ной перекиси водорода. Молочно-кислые микроорганизмы, в том числе бактерии рода Pediococcus, не содержат цитохромов. В случае присутствия цитохромов колонии окрашиваются в голубовато-зеленый или ярко-голубой цвет.
При отсутствии бензидина допускается проводить определение наличия псевдокаталазы на среде п. 3.2.15 с низкой концентрацией глюкозы — 0,05%.
Посевы инкубируют по п. 4.1.4, определение псевдокаталазы проводят также как и каталазы по ГОСТ 10444.3. ;
Культуры, образующие псевдокаталазу, относят к роду Pediococcus. ;
При идентификации бактерий рода Leuconostoc готовят препараты и окрашивают их по Бури для выявления бактериальных капсул. Для этого на хорошо обезжиренном и обожженном предметном стекле смешивают каплю бактериальной культуры с мелким порошком черной туши или суспензией нигрозина.
С помощью другого стекла со шлифованными краями быстро готовят тонкий мазок, который фиксируют, несколько раз проводя его через пламя горелки. Мазок докрашивают раствором кристаллического фиолетового или рабочим раствором карболфуксина. Осторожно промывают в сосуде с водой, оставляют на воздухе для высыхания и микроскопируют. Не допускается сушить мазок ме- ■ жп; листами (Ьильтпбвальной бумаги. Фон препарата окрашива-
ГОСТ 10444Л1—89 С. 12
ется тонкой суспензией черной туши или нигрозина. Тела бактерий окрашиваются монохроматично, капсулы остаются неокрашенными.
При идентификации стрептококков группы N рода Streptococcus, стрептококков вида S. tiermophilus определяют отсутствие роста на мясопептонном бульоне с pH 9,6 и на мясопептонном бульоне с содержанием хлористого натрия 6,5%.
Для этого культуры по п. 4.1.8 пересевают на среды, указанные в пп. 3.2.8 и 3.2.9.
Посевы инкубируют при температуре (ЗО±1)°С в течение 3 сут, а при идентификации S. thermophilus посевы инкубируют при (45± 1) °С в течение 3 сут.
П рсведен ие испытания кисломолочных продуктов, заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочн о-к ис л ых бактерий
Приготовление разведений кисломолочных продуктов (сухих и жидких) по ГОСТ 9225.
Для приготовления разведений заквасок, бактериальных концентратов и бактериальных препаратов молочно-кислых бактерий края флакона и пакета протирают спиртом, край флакона обжигают и вынимают пробку, край пакета надрезают профламбиро- ванными ножницами, отвешивают 1 г испытуемого материала в стерильную или профламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри или стерильной бумагой, тщательно растирают, добавляя небольшое количество раствора хлористого натрия или фосфатного буфера из колбы, содержащей 99 см3 раствора или буфера. Суспензированный материал переливают в колбу с оставшимся раствором хлористого натрия или фосфатного буфера и получают второе разведение 1 :100.
