Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Sаlmоnеllа

При посеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2.

При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах.

Доведение рН проводят асептически с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 18-20 ч.

5.2 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 5.1, пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см культуры переносят в 100 см магниевой среды, приготовленной по 4.2.2, и в 100 см тетратионатной среды, приготовленной по 4.2.4, или по 10 см культуры переносят в 100 см селенитовой среды, приготовленной по 4.2.3, и в 100 см тетратионатной среды.

Посевы инкубируют в течение 24-48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36±1) °С, а на тетратионатной среде при температуре (43±1) °С.

5.3 Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах

Культуры через 24 и 48 ч инкубирования по 5.2 пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризованные среды, приготовленные по 4.2.5: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).

Допускается использование одной чашки каждой из сред одновременного высева с двух селективных сред.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч.

После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный.

После инкубирования посевов отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода Salmonella:

на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;

на среде Плоскирева колонии бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;

на среде Эндо колонии круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;

на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.

При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.

При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колоний проводят их дальнейшее изучение.

5.4 Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных характерных колоний к бактериям рода Salmonella

5.4.1 Не менее трех характерных колоний с каждой дифференциально-диагностической среды (см. 5.3) пересевают на скошенную поверхность мясо-пептонного агара или среды из сухого питательного агара, приготовленных по 4.2.14, и часть колоний пересевают штрихом по поверхности и уколом в столбик трехсахарного агара, приготовленного по 4.2.6.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

5.4.2 Из отобранных по п.5.4.1 для биохимического подтверждения колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму.

Бактерии рода Salmonella являются грамоотрицательными палочками с закругленными концами.

5.4.3 После инкубирования посевов, как указано в 5.4.1, проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре:

пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;

пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа, пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;

почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.

Типичными для бактерий рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.

Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.

5.4.4 У культур, отобранных согласно 5.4.3 и пересеянных предварительно, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара, изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита и подвижность.

5.4.5 Определение расщепления мочевины

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной, приготовленного по 4.2.7.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

При положительной реакции - расщеплении мочевины цвет среды от розового до светло-вишневого. Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.

5.4.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера)

Культуры пересевают в мясо-пептонный бульон с глюкозой, приготовленный по 4.2.10.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч.

После инкубирования к 1 см отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см раствора -нафтола, приготовленного по 4.1.5, и 0,2 см раствора гидроокиси калия концентрации 400 г/дм . После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

5.4.7 Определение образования индола

Культуры пересевают в бульон Хоттингера, приготовленный по 4.2.11, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном, приготовленный по 4.2.12.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

После инкубирования к посевам прибавляют по 1 см реактива Эрлиха или Ковача, приготовленных соответственно по 4.1.3 и 4.1.4.

Образование красного слоя указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют индол.

5.4.8 Определение ферментации маннита и сахарозы

Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой, приготовленные по 4.2.13.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

Бактерии рода Salmonella не сбраживают сахарозу, не сбраживают маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.

5.4.9 Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий мясо-пептонный агар.

Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24 ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур - вдоль места укола.

Большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны.

5.5 Результаты биохимического подтверждения культур оценивают, пользуясь таблицей приложения.

5.6 Серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella

Серологическое подтверждение принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, давшими типичные биохимические реакции согласно приложению, и предварительно пересеянными, как указано в 5.4.1, на поверхность мясо-пептонного агара или среды, приготовленной из сухого питательного агара.

5.6.1 Определение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора, приготовленного по ГОСТ 10444.1, на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Покачивают осторожно стекло в течение 30-60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

5.6.2 Определение наличия 0-антигенов

Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, В, С, D, Е, а затем, если не выявлено 0-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в наставлении, прилагаемом к сывороткам.

Агглютинация (наличие 0-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

5.7 При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разд.3.

6 Оценка результатов

6.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

6.2 Интерпретация биохимических и серологических испытаний

Культуры, показавшие типичные биохимические и серологические реакции, относят к бактериям рода Salmonella.

Предположительно к бактериям рода Salmonella относят:

культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации и 0-антигенов, но показавшие типичные биохимические реакции;

культуры, у которых обнаружена самоагглютинация и типичные биохимические реакции.

Культуры, у которых не обнаружено самоагглютинации, не давшие типичных биохимических и серологических реакций, не относят к бактериям рода Salmonella.

6.3 Результаты выявления бактерий рода Salmonella в определенной навеске продукта записывают: "бактерии рода Salmonella обнаружены в г (см ) продукта" или "бактерии рода Salmonella не обнаружены в г (см ) продукта".

- масса (объем) навески продукта, в которой выявляли бактерии рода Salmonella.

ПРИЛОЖЕНИЕ

(обязательное)

Биохимическая характеристика четырех подродов Salmonella

и атипичных видов, входящих в подрод Salmonella I

Текст документа сверен по:

официальное издание

Молоко и молочные продукты.

Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -

М.: ИПК Издательство стандартов, 2004