5.2.2. Опытным путем подбирают такие разведения исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, при введении которых погибают все мыши, и последующие разведения, при которых мыши не погибают.
Если использование 10-кратных разведений не приводит к гибели всех мышей ни в одном из разведений, то для определения титра ботулинического токсина готовят 6- или 4-кратные разведения исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом. По наибольшему разведению жидкости, вызвавшему гибель всех мышей, вычисляют число мышиных MLD ботулинического токсина в 1 см исходной жидкости с последующим пересчетом на продукт (обязательное приложение 1).
5.3. Серологическое типирование токсина С.botulinum
5.3.1. Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина защитным тестом
5.3.1.1. Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости обнаруживают путем постановки биологической пробы на мышах, защищенных иммунизацией противоботулиническими антитоксическими сыворотками типов А, В, Е (и, если представляется возможным, типов С, D, F, G). Сыворотка типа С должна содержать антитоксины типов С и С . Поливалентные сыворотки и типы поливалентных сывороток для опыта подбирают в зависимости от вида анализируемого продукта и предполагаемого типа ботулинического токсина в соответствии с комбинациями и порядком, приведенными в табл.2 и 3.
Таблица 3
Подбор противоботулинических сывороток для типирования
ботулинических токсинов в ИЖ (ИЖТ)
|
Номер вари- анта опыта |
Анализируемый продукт |
Типы используемых противоботулинических сывороток и их комбинации |
Типы выявляемых ботулинических токсинов или их комбинации |
|
1 |
Не прошедший термическую обработку |
Моновалентные типов А, В, Е |
А, В, Е(F) |
|
|
|
и трехвалентная типов А, В, Е |
А+В+Е(F) |
|
2 |
Тот же, не содержащий ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 1-му варианту опыта |
Моновалентная типа F |
F(E) |
|
|
|
Моновалентная типа С |
C(D) |
|
3 |
Прошедший термическую обработку |
Моновалентная типа А и В, бивалентная АВ |
А; В; А+В |
|
4 |
Тот же, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 3-му варианту опыта |
Моновалентная типа F |
F(E) |
|
|
|
Моновалентная типа Е |
E(F) |
|
|
|
Моновалентная типа С |
C(D) |
|
5 |
Любой, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемых по 1-4-му вариантам опыта |
Бивалентные типы: АС |
А+С(D) |
|
|
|
АЕ |
А+Е(F) |
|
|
|
AF |
А+F(E) |
|
|
|
ВС |
В+С(D) |
|
|
|
BE |
В+Е(F) |
|
|
|
BF |
В+F(E) |
|
|
|
СЕ |
С(D)+Е(F) |
|
|
|
CF |
С(D)+F(E) |
|
|
|
EF |
Е+F |
|
|
Любой, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемые по 1-4-му вариантам опыта |
Трехвалентные типы: ABF |
А+В+F(Е) |
|
|
|
ВСЕ |
В+C(D)+E(F) |
|
|
|
ВСF и другие |
В+C(D)+F(E) и другие |
|
|
|
Поливалентная типа ABCEF |
А+В+C(D)+Е+F |
|
6 |
Тот же, не содержащий типы ботулинических токсинов или их комбинаций, выявляемые по 1-5-му вариантам опыта |
Моновалентная типа D |
D(C) |
|
|
|
Моновалентная типа G |
G |
|
|
|
Поливалентная типов А, В, С, D, E, F |
(A+B+C+D+E+F+G) и другие комбинации, в соответствии с комбинациями использованной сыворотки |
Примечания:
1. Исследование начинают с использования комбинации с наибольшим количеством типов сывороток, и в случае, если использованная комбинация типов сывороток защищает мышей от гибели, типируют ботулинические токсины моно-, би- или трехвалентными сыворотками, указанными в соответствующем варианте опыта.
2. В скобках указана возможная перекрестная реакция при типировании ботулинических токсинов.
5.3.1.2. Для типирования с помощью защитного теста используют противоботулинические антитоксические типоспецифические сыворотки, разведенные физиологическим раствором до концентрации 1 МЕ/см . Разведенные сыворотки хранят при температуре (4±2) °С в течение не более 10 сут.
Если при использовании сывороток, разбавленных до 1 МЕ/см , установить тип ботулинического токсина не удается, то биологическую пробу повторяют с сыворотками, разбавленными до концентрации 0,1 МЕ/см .
При использовании противоботулинических антитоксических типоспецифических сывороток, содержащих 1 МЕ/см , исходную жидкость (и/или исходную жидкость, обработанную протеолитическим ферментом) разводят буферным желатино-фосфатным раствором в соотношениях, позволяющих получить не менее трех последовательных разведений жидкости, содержащей в 10, 100 и 1000 раз меньше MLD, чем обнаружено в исходной жидкости.
5.3.1.3. При постановке защитного теста для типирования ботулинических токсинов каждому животному внутрибрюшинно вводят по 0,5 см моновалентной, двух-, трех- или поливалентной сыворотки. Для инъекции одного типа сыворотки или их смеси каждой группе животных применяют отдельный шприц. Через 60 мин после введения сывороток животным вводят исходную жидкость, подготовленную по п.5.3.1.2. Введение животным исходной жидкости начинают с наибольшего ее разведения, используя один шприц для группы мышей, получивших моновалентную сыворотку одного типа или двух-, трех- или поливалентную сыворотку, состоящую из одной комбинации моновалентных сывороток.
5.3.1.4. При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те мыши, которым введена сыворотка, не гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости. Погибают также мыши, которые получили гомологичную сыворотку в объеме, недостаточном для защиты от высокой дозы токсина. Мыши, получившие сыворотку, в состав которой входит моновалентная сыворотка, гомологичная типу ботулинического токсина в исходной жидкости, остаются живы. Если болеют и погибают все животные, то биологическую пробу повторяют, применяя более разбавленную исходную жидкость или ранее не использованные комбинации моновалентных сывороток.
5.3.2. Подтверждение присутствия и установление типа ботулинического токсина реакцией нейтрализации
Присутствие ботулинического токсина в исходной жидкости подтверждают реакцией нейтрализации с концентрированными противоботулиническими антитоксическими сыворотками в случаях, когда имеется для этого достаточное количество сывороток и исходная жидкость содержит более 4 мышиных MLD/см .
Допускается одновременное установление присутствия и типа ботулинического токсина путем постановки развернутой реакции нейтрализации.
Концентрированные сыворотки применяют при необходимости с целью подтверждения присутствия ботулинических токсинов в исходной жидкости в наиболее короткий срок с наименьшим количеством животных без предварительного определения титра ботулинического токсина.
5.3.2.1. Для постановки реакции нейтрализации и типирования ботулинических токсинов концентрированными антитоксическими диагностическими противоботулиническими сыворотками используют сухие сыворотки, имеющие титр в пределах: для типа А - 200-440 ME; для типа В - 100-200 ME; для типа Е - 200-400 ME; по возможности реакция ставится с сыворотками типа С - 200-300 ME, типа F - 50 ME.
Непосредственно перед использованием ампулы с сухими сыворотками вскрывают, добавляют в каждую ампулу 1 см дистиллированной воды и, легко встряхивая, добиваются полного растворения сыворотки. Затем сыворотки типов А, В, С, Е разводят в 10 раз, а сыворотки типа F - в 5 раз физиологическим раствором. Хранят при температуре (4±2) °С в течение не более 10 сут.
5.3.2.2. При использовании диагностических сывороток присутствие ботулинических токсинов в исходной жидкости или исходной жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, подтверждают реакцией нейтрализации. Для проведения реакции нейтрализации в чистую пробирку стерильной пипеткой с грушей переносят 2,4 см исходной жидкости или исходной жидкости, обработанной протеолитическим ферментом. Затем в нее вносят по 0,12 см сывороток пяти типов С.botulinum, или по 0,15 см сывороток четырех типов С.botulinum, или по 0,2 см трех типов С.botulinum. Каждый тип сыворотки отбирают для приготовления поливалентной сыворотки отдельной стерильной микропипеткой. После выдержки в течение 30-45 мин приготовленную смесь вводят по 1 см белым мышам. В случае гибели животных реакцию повторяют с исходной жидкостью или жидкостью, обработанной протеолитическим ферментом, разбавленной буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1:9, а в случае необходимости - в большей степени. Результаты реакции оценивают по п.5.3.1.4.
5.3.2.3. Для установления типа ботулинического токсина с помощью диагностических сывороток стерильной пипеткой с резиновой грушей по 2,4 см исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, разливают в несколько пробирок, затем в каждую пробирку отдельными стерильными пипетками добавляют по 0,6 см моновалентных сывороток для типирования ботулинического токсина одного типа, по 0,3 см моновалентных сывороток для типирования смеси ботулинических токсинов двух типов и по 0,2 см моновалентных сывороток для типирования смеси ботулинических токсинов трех типов в соответствии с табл.3.
В случаях, если необходимо избежать перекрестных неспецифических реакций с негомологичными сыворотками для разделения ботулинических токсинов типов Е и F, С и D и других типов, концентрированные сыворотки разводят до концентрации 1 (0,1) МЕ/см .
5.3.2.4. Для постановки развернутой реакции нейтрализации и типирования ботулинического токсина сыворотками после их разведения in vitro поступают следующим образом. В пробирку пипеткой с резиновой грушей переносят исходную жидкость или жидкость, обработанную протеолитическим ферментом и, при необходимости, готовят одной пипеткой в пробирках серию разведений этой жидкости в соотношении, подобранном по п.5.2.1. Затем другой пипеткой с резиновой грушей последовательно, начиная с наибольшего разведения, переносят по 2,4 см из каждого разведения жидкости в серию из нескольких пробирок. Количество пробирок для каждого разведения соответствует числу типов моно-, двух-, трех- и поливалентных комбинаций сывороток, используемых в реакции нейтрализации и типировании ботулинических токсинов. В каждую серию пробирок с разведенной исходной жидкостью, начиная с наибольшего разведения, стерильной пипеткой добавляют по 0,6 см моно-, двух-, трех- или поливалентной сыворотки одного состава. Приготовленные смеси выдерживают в течение 30-45 мин при комнатной температуре. После окончания выдержки по 1 см смеси, отобранной от каждой пробирки, вводят двум белым мышам. Мыши, которые получили смеси, содержащие моно-, двух-, трех- или поливалентные сыворотки, гомологичные типу ботулинического токсина или нескольким типам ботулинического токсина, содержащегося в исходной жидкости, остаются живы; мыши, не получившие сыворотки гомологического типа, болеют и погибают с симптомами ботулинической интоксикации. Допускается одновременно подсчитывать титр токсина.
5.4. Выявление С.botulinum
5.4.1. Для выявления С.botulinum питательные среды для высева навесок продукта выбирают по табл.4, используя одну из сред, предложенных для высева 1-й навески, и одну из сред, предложенных для высева 3-й навески.
Таблица 4
Схема посевов в питательные среды для выявления С.botulinum
|
Номер на- вески |
Пищевой продукт |
Питательная среда для посева |
Обработка посевов |
Темпе- ратура термо- стати- рования, °С |
|
1 |
Любой, кроме консервов, при подозрении на присутствие вегетативных клеток С.botulinum типов А, В, С, D, F, разлагающих казеин |
Печеночно-глицериновая; улучшенная клостридиальная; из вареного мяса; Китт-Тароцци; бульон с кониной и мальтозой |
Без обработки |
36±1 |
|
|
Консервы |
То же |
То же |
30±1 |
|
2 |
Любой, кроме консервов, при подозрении на присутствие спор С.botulinum типов А, В, С, D, F, разлагающих казеин |
" |
Прогрев (60±1) °С или при (80±1) °С в течение 15 мин |
36±1 |
|
|
Консервы |
|
То же |
30±1 |
|
3 |
Любой при подозрении на присутствие С.botulinum типов В, С, D, E, F, не разлагающих казеин |
Триптиказо-пептонно-глюкозная с дрожжевым экстрактом; питательная для определения стерильности; Хоттингера; бульон с кониной и мальтозой - с добавлением трипсина |
Без обработки |
30±1* |
|
4 |
Любой при подозрении на присутствие спор С.botulinum типов В, С, D, E, F, не разлагающих казеин; навеску продукта обрабатывают спиртом |
То же, но без добавления трипсина |
То же |
30±1* |
