---

3.2.12. Бульон с кониной и мальтозой: к 1000 см воды добавляют 500 г конины, кипятят в водяной бане в течение 1 ч, фильтруют, в фильтрат добавляют 30,0 г ферментативного пептона, 2,32 г двузамещенного фосфата натрия, 10,0 г мальтозы. Смесь кипятят на водяной бане в течение 30 мин, устанавливают рН (7,6±0,2), фильтруют, разливают по 10 см в пробирки, после чего в каждую пробирку вводят 1-1,5 г вареной и измельченной конины. Пробирки стерилизуют в течение 15 мин при температуре (121±1) °С.

Применяют для культивирования С.botulinum.

3.2.13. Питательный агар с кровью и глюкозой: к 1000 см деионированной воды добавляют 17,0 г ферментативного пептона, 15 см дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0±3,0) г агара, 20,0 г глюкозы, устанавливают рН (7,2±0,2), стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. После стерилизации и охлаждения до 50 °С добавляют 200 см крови. Допускается добавление в среду неомицина до конечной концентрации 50 мг/см или циклосерина до 400 мг/см .

Применяют для выделения С.botulinum.

3.2.14. Питательный агар с яичным желтком и лактозой: к 1000 см деионированной воды добавляют 17,0 ферментативного пептона, 15 см дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлористого, (17,0±3,0) г агара, устанавливают рН (7,2±0,2), стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин. В стерильную расплавленную среду добавляют 20,0 г лактозы, смесь прогревают в течение 30 мин в водяной бане в кипящей воде. После охлаждения до 50 °С добавляют асептически 10 см 0,4%-ного раствора бромкрезолпурпура и 100 см эмульсии яичного желтка.

Применяют для выделения С.botulinum.

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Подготовка продукта к испытанию на наличие ботулинических токсинов

4.1.1. Для выявления ботулинических токсинов отбирают 100 см /г жидкого продукта, культуральной жидкости анаэробных посевов, жидкую фракцию продуктов смешанного состава, водные экстракты или экстракты, приготовленные с физиологическим раствором пастообразных, сыпучих продуктов и продуктов твердой консистенции. Объем приготовленной исходной жидкости должен составлять около 30 см . Оставшееся количество исходной жидкости используют, при необходимости, для повторного испытания.

При отсутствии продукта в достаточном количестве выявляют ботулинические токсины в исходной жидкости меньшего объема.

Экстракты из сыпучих и твердых продуктов, нерастворимых в воде, получают из соленых продуктов (содержащих более 2% NaCl) при добавлении дистиллированной воды в соотношении 1:1 или 1:2, из несоленых и предварительно восстановленных продуктов тепловой и сублимационной сушки - при добавлении такого же количества физиологического раствора.

Предварительно измельченный ножом или ножницами продукт переносят в стерильную ступку, добавляют при необходимости стерильный песок или стерильную стеклянную крошку и доводят до однородной консистенции, постоянно добавляя воду или физиологический раствор. Смесь переносят в стерильную колбу.

Водорастворимые или пастообразные продукты смешивают с водой или физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2 в стерильной колбе.

Полученные смеси выдерживают при температуре (4±2) °С в течение 2 ч и затем извлекают из них жидкую фракцию.

Прогрев и ротационную гомогенизацию продукта для выявления ботулинических токсинов не проводят; продукт измельчают в ступке.

Жидкую фракцию отделяют от продукта отстаиванием и (или) фильтруют через ватно-марлевый или другой фильтр, не адсорбирующий ботулинические токсины, или центрифугируют при температуре (4±2) °С и частоте вращения 500 с в течение 1-2 мин. Использование асбестовых фильтров или фильтровальной бумаги не допускается. Подготовленную таким образом исходную жидкость переносят в стерильную колбу; хранят при температуре (4±2) °С не более 7 сут.

4.2. Подготовка продукта к испытанию для выявления и выделения С.botulinum

4.2.1. Для выявления и выделения С.botulinum отбирают 100 см /г продукта из различных мест, имеющих и не имеющих изменения; гомогенизируют по ГОСТ 26669-85 или доводят до однородной консистенции. Допускается для посева использовать продукт, оставшийся после отделения или экстрагирования из него жидкой фазы.

Для выявления в любых продуктах вегетативных клеток и спор С.botulinum приготавливают не менее четырех навесок массой 20,0-25,0 г (см ) любого продукта.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1. Выявление ботулинических токсинов

5.1.1. Выявление ботулинических токсинов проводят по табл.1 или одновременно с использованием противоботулинических антитоксических сывороток по табл.2. Исследования проводят с исходной жидкостью (ИЖ), если в ней ботулинический токсин не обнаружен, то ИЖ обрабатывают протеолитическим ферментом.

Таблица 1

Постановка исследований по обнаружению ботулинического токсина

и определению титра токсина в исходной жидкости

Примечания:

1. ИЖ - исходная жидкость; Ж - жидкость, подготовленная соответствующим способом из ИЖ или ИЖТ для введения каждой из двух белых мышей; ИЖТ - исходная жидкость, обработанная протеолитическим ферментом; ЖФБ - буферный желатино-фосфатный раствор. Если предполагается наличие токсина С.botulinum E, то разведения более 1 ИЖТ + 999 ЖФБ не готовят.

2. Допускается титр ботулинического токсина не определять.

Таблица 2

Постановка исследований по обнаружению и типированию

ботулинических токсинов

________________

* При перекрестной реакции с сывороткой типа Е.

Для выявления ботулинических токсинов по табл.1 используют исходную жидкость. В две пробирки пипеткой с резиновой грушей переносят по 2-3 см , а в третью - 2,7 см исходной жидкости. В последнюю пробирку стерильной пипеткой добавляют 0,3 см раствора трипсина или панкреатина. В смеси исходной жидкости с ферментом с помощью раствора гидроокиси натрия или раствора соляной кислоты устанавливают рН (6,0±1). Затем пробирку со смесью термостатируют при (37±1) °С в течение 1 ч, но не дольше, периодически перемешивая содержимое. Культуральную жидкость, полученную из посевов продуктов в питательную среду, содержащую трипсин или панкреатин, протеолитическим ферментом не обрабатывают.

Вторую пробирку с исходной жидкостью кипятят на водяной бане в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Первую пробирку с исходной жидкостью оставляют без обработки.

Хранение исходной жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, не допускается.

Непосредственно после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим ферментом ставят биологическую пробу на белых мышах.

5.1.2. По 0,5-1,0 см подготовленной соответствующим образом исходной жидкости вводят в зависимости от условий опыта внутрибрюшинно не менее чем двум белым мышам, в соответствии с приложением 2. Животных осматривают через 1, 2, 4, 12 ч и далее не менее двух раз в день в течение 72 ч. Ботулинические токсины не вызывают молниеносной гибели животных; клинические симптомы ботулинической интоксикации животных токсином типа Е, как правило, появляются через 2-4 ч, токсином других типов - через 10-12 ч после инъекции. Высокие концентрации токсина могут вызвать гибель мышей в течение 1-2 ч без проявления клиники ботулизма. В этом случае ставят повторно биологическую пробу с исходной жидкостью, разведенной в 10-100 раз. Мыши болеют и погибают не раньше, чем через 2 ч после инъекции токсина, чаще всего в течение 4-6 ч. Клинические симптомы болезни и гибели мышей при ботулинической интоксикации очень характерны: шерсть взъерошивается, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают, давая симптом "осиная талия"; появляются судороги, паралич задних конечностей; гибель при явлениях полного паралича из-за остановки дыхания.

5.1.3. При наличии в исходной жидкости ботулинического токсина болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации те животные, которым введена необработанная протеолитическим ферментом жидкость, и, если фермент не инактивировал ботулинический токсин, то болеют и погибают животные, которым введена жидкость, обработанная протеолитическим ферментом. При наличии в исходной жидкости ботулинических протоксинов болеют и погибают с клиническими симптомами ботулинической интоксикации в первую очередь те животные, которым введена обработанная ферментом жидкость; мыши, которым введена не обработанная ферментом жидкость, могут переболеть, но не погибают или погибают позже. Мыши, которым введена прокипяченная жидкость, должны оставаться на всем протяжении опыта здоровыми. Если болеют или погибают мыши, получившие прокипяченную и непрокипяченную жидкость, то исходную жидкость разводят буферным желатино-фосфатным раствором в соотношении 1:1 и 1:9 и повторяют исследования по вышеописанному методу с тем, чтобы избежать гибели животных от прокипяченной жидкости или подтвердить, что клинические признаки гибели животных по всем вариантам опыта не соответствуют признакам ботулинической интоксикации.

При наличии в исходной жидкости ботулинических токсинов все последующие исследования проводят с необработанной жидкостью (ИЖ); ботулинических протоксинов - с жидкостью, обработанной протеолитическим ферментом (ИЖТ).

5.2. Определение титра ботулинического токсина

5.2.1. Для определения титра ботулинического токсина используют исходную жидкость, содержащую ботулинический токсин, или ту же жидкость, содержащую протоксин и обработанную непосредственно перед поставкой биологической пробы протеолитическим ферментом. Пипеткой с резиновой грушей по 1 см исходной жидкости или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом, переносят в две пробирки; в одну стерильной пипеткой добавляют 1 см , получая разведение 1:1, в другую - 9 см буферного желатино-фосфатного раствора, получая разведение 1:9. Из пробирки с жидкостью, разведенной в 10 раз, стерильной пипеткой с резиновой грушей отбирают 1 см и переносят в третью пробирку, в которую стерильной пипеткой добавляют 9 см раствора желатино-фосфатного буфера, получая разведение 1:99. При ограниченном объеме исходной жидкости из нее готовят те же разведения, но получают вышеуказанные соотношения между исходной жидкостью и желатино-фосфатным буфером, используя меньший объем исходной жидкости и раствора желатино-фосфатного буфера. С полученными разведениями исходной жидкости (или жидкости, обработанной протеолитическим ферментом) ставят биологические пробы в порядке, приведенном в табл.1.