---

ГОСТ 10444.2-94

Группа Н09

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Методы выявления и определения количества

Staphylococcus aureus

Food products. Methods for detection and quantity determination

of Staphylococcus aureus

МКС 07.100.30

ОКСТУ 9109

Дата введения 1996-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"

ВНЕСЕН Госстандартом России

2 ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 6 от 21 октября 1994 г.)

За принятие проголосовали:

3 Настоящий стандарт представляет собой полный аутентичный текст ИСО 6888-83 "Общее руководство по определению Staphylococcus aureus. Метод подсчета колоний" в части определения количества Staphylococcus aureus и содержит дополнительные требования, отвечающие потребности экономики страны

4 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 21 февраля 1995 г. N 76 ГОСТ 10444.2-94 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 января 1996 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 10444.2-75

6 ПЕРЕИЗДАНИЕ

1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus (S. aureus) посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на агаризованные селективно-диагностические среды.

Метод выявления S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) S. aureus.

Метод выявления S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см жидкого продукта более 15 КОЕ S. aureus.

Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 1500 или в 1 см жидкого продукта менее 150 КОЕ S. aureus.

Метод определения количества S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см жидкого продукта более 150 КОЕ S. aureus.

2 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

______________

* С 01.07.2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

3 СУЩНОСТЬ МЕТОДОВ

Методы выявления и определения НВЧ S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведении навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных характерных колоний к S. aureus.

Методы выявления и определения количества S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта или разведения навески продукта на агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете количества характерных колоний (при определении количества S. aureus), подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных характерных колоний к S. aureus.

4 ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 или по нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

5 АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Для проведения анализа применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1, а также указанные ниже:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 4-го класса точности (для взвешивания продукта);

лупа с увеличением 5-10 ;

микроскоп световой биологический с увеличением 900-1000 ;

петля бактериологическая;

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С;

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК);

кальций хлористый;

сухая плазма кроличья;

толуидин синий "С";

трисаминометан.

6 ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

6.1 Приготовление растворов и реактивов

6.1.1 Физиологический раствор готовят по ГОСТ 10444.1.

6.1.2 Раствор лимоннокислого натрия концентрации 50 г/дм : 5,0 г лимоннокислого натрия переносят в колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки, разливают по колбам или пробиркам и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 20 мин.

6.1.3 Раствор хлористого кальция концентрации 1 г/дм : 0,1 г хлористого кальция переносят в колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

6.1.4 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% готовят по ГОСТ 10444.1, п.4.33.

6.1.5 Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1, п.4.25.

6.1.6 Раствор толуидина синего "С" концентрации 10 г/дм : 1,0 г толуидина синего "С" переносят в колбу вместимостью 100 см , растворяют в дистиллированной воде, доводят дистиллированной водой до метки.

6.1.7 Цитратная плазма крови кролика: свежеполученную в асептических условиях из сердца кровь кролика тщательно смешивают в соотношении 4:1 со стерильным раствором лимоннокислого натрия, приготовленного по п.6.1.2. Полученную смесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об/мин или отстаивают на холоде, затем плазму отсасывают пипеткой и разводят ее из расчета 1 см плазмы на 4 см физиологического раствора. Разведенную плазму по 0,5 см разливают в стерильные пробирки.

6.2 Приготовление питательных сред

6.2.1 Байрд-Паркер агар готовят по ГОСТ 10444.1, п.5.1.

6.2.2 Молочно-солевой агар готовят по ГОСТ 10444.1, п.5.4.

6.2.3 Мясо-пептонный агар (бульон) готовят по ГОСТ 10444.1, п.5.12.

6.2.4 Солевой или сахарный бульон: 6,0 г хлористого натрия или 1,0 г глюкозы растворяют в 100 см мясо-пептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25 °С 6,9±0,1. Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

6.2.5 Среду из сухого питательного агара готовят по прописи, указанной на этикетке.

6.2.6 Среда с ДНК: растворяют в 1000 см дистиллированной воды 6,1 трисаминометана и доводят по ГОСТ 10444.1 рН раствора до 9,0±0,1.

К раствору добавляют 0,3 г ДНК, 10,0 г хлористого натрия, 1,1 см раствора хлористого кальция концентрации 1 г/дм , 15,0 г агара, нагревают до полного расплавления агара. К охлажденной до 65-55 °С среде добавляют 9,2 см раствора толуидина синего, приготовленного по п.6.1.6, тщательно перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри. Допускается хранение среды при температуре (6±2) °С не более 7 сут.

6.2.7 Яично-желточно-азидный агар готовят по ГОСТ 10444.1, п.5.7.

6.2.8 Яично-желточно-солевой агар готовят по ГОСТ 10444.1, п.5.8.

6.2.9 Среда Гисса с мальтозой выпускается в сухом виде и готовится по прописи, указанной на этикетке.

7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1 Посевы для определения количества S. aureus

7.1.1 Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см ) продукта предполагаемое количество S. aureus или их количество, указанное в нормативно-технической документации на анализируемый продукт.

7.1.2 При определении количества S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см продукта или его разведения наносят на поверхность одной из сред, указанных в п.6.2: Байрд-Паркер агара, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Преимущественно для посева используют Байрд-Паркер агар. Для посева продукта или каждого его разведения используют две параллельные чашки Петри со средой. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.

7.1.3 При определении количества S. aureus по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.

Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из сред, приготовленных по п.6.2.4.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведения и питательной средой 1:6 или 1:7.

7.2 Посевы для выявления S. aureus в определенной навеске продукта

7.2.1 При выявлении S. aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред, приготовленных по п.6.2.4.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:6 или 1:7.

7.2.2 При выявлении S. aureus в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении без предварительного обогащения эту навеску или разведение в количестве 0,1 или 0,2 см наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред, как указано в п.7.1.2.

7.3 При посеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения рН сахарного или солевого бульона на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2.

При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах, или при приготовлении сахарного или солевого бульона рН устанавливают выше указанного в п.6.2.4, с учетом его последующего снижения при внесении продукта. Если высевают не твердый продукт, а его исходное разведение, то рН доводят в исходном разведении.

Доведение рН проводят асептически с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной или лимонной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия устанавливают опытным путем.

7.4 При анализе пищевых продуктов с большим содержанием NaCI проводят посев продукта или его исходного разведения в сахарный бульон, во всех других случаях для посева используют солевой бульон.

7.5 Посевы по пп.7.1 и 7.2 на агаризованных жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

7.6 Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них после инкубирования по п.7.5 делают пересевы петлей по ГОСТ 26670 на поверхность одной из селективно-диагностических сред, указанных в п.7.1.2. Посевы инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч.

7.7 Посевы по пп.7.1.2, 7.2.2, 7.6 на агаризованных средах после инкубирования просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На Байрд-Паркер агаре колонии S. aureus выглядят черными, блестящими, 1,5-2,5 мм в диаметре, окружены зоной лецитиназной активности.

На молочно-солевом агаре колонии S. aureus круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет.