При взятии пробы с мелких предметов обтирают всю поверхность предмета. Ватные или марлевые тампоны готовят отдельно следующим образом: ватный или марлевый тампон заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин, после стерилизации тампоны подсушивают в сушильном шкафу.
Перед взятием пробы тампон увлажняют, погружая его в пробирку с 10 см3 стерильной водопроводной воды. После взятия пробы тампон помещают в эту же пробирку. Содержимое пробирки тщательно перемешивают 1 см3 и 0,1 см3 подготовленной пробы высевают в чашки Петри. Посевы заливают расплавленным и охлажденным до 45 °С СПА или МПА, содержащим 1% глюкозы.
Результаты посевов учитывают через 24 ч после термостатирования при 37 °С. Количество микроорганизмов вычисляют на 1 см2 площади исследуемого объекта по формуле:
,
где X - число микроорганизмов на 1 см2 поверхности;
A - число колоний выросших на питательной среде в чашке;
B - количество воды, находящейся в пробирке;
- площадь шаблона в см2.
После санитарной обработки общая обсемененность 1 см2 поверхности оборудования, изготовленного из металла, стекла, резины, пластмассы, дерева, не должна превышать 300 микробных клеток. Обсемененность оборудования в цехах, производящих продукты детского и диетического питания, должны быть не более 50 микробных клеток на 100 см2 поверхности оборудования.
После высева 1 см3 и 0,1 см3 подготовленной пробы для определения общей бактериальной обсемененности в пробирку добавляют 1 см3 концентрированной среды Эйкмана и содержимое пробирки перемешивают. Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 43 °С. Через 48 ч из засеянных пробирок со средой Эйкмана, в которых наблюдается появление мути и газообразования или появление только одной мути, производится посев на чашки Петри со средой Эндо. Для пересева берут петлей минимальное количество материала и размазывают его штрихом по поверхности агара. Посевы выдерживают в течение 24 ч при температуре 37 °С.
На среде Эндо колонии бактерий группы кишечной палочки имеют вид круглых с ровным краем, блестящих, слегка выпуклых, в диаметре не более 3-х мм колоний, которые могут быть красными с металлическим блеском, красными без блеска, розовыми с красным центром, а также белыми.
Из типичных для бактерий групп кишечной палочки колоний готовят мазки и окрашивают по Граму.
Для приготовления препаратов на обезжиренном спиртом предметном стекле делают тонкий мазок, который фиксируют проводят троекратно над пламенем горелки. Фиксированный препарат окрашивают 1%-ным водным раствором метилового фиолетового, погружая его на 30 с, а затем раствором йода по Бурке (йодистый калий - 3 г, йод - 1 г, вода дистиллированная - 100 см3) в течение 1 мин, далее ацетоном, погружая в него препарат и тотчас вынимая, и, наконец 0,5%-ным водным раствором сафранина в течение 2-3 мин. После каждого этапа окрашивания препарат промывают в проточной водопроводной воде. Подсушенный на воздухе препарат микроскопируют.
Грамположительные микробы окрашиваются в темно-фиолетовый, грамотрицательные - в красный цвет. Отсутствие в мазках грамотрицательных палочек свидетельствует об отсутствии бактерий группы кишечной палочки.
При наличии в мазке грамотрицательных палочек ставят пробу на среде Гисса с глюкозой и индикатором Андредэ. Для этого подозрительную колонию переносят петлей в среду Гисса. Посевы термостатируют 24 ч при 43 °С. Изменение цвета и газообразование среды подтверждает присутствие бактерий группы кишечной палочки.
Наличие бактерий группы кишечной палочки в смыве со 100 см2 поверхности оборудования и инвентаря, соприкасающейся по ходу технологического процесса с продукцией, не допускается.
2. Контроль чистоты тары
Ежесменно проводят бактериологический контроль качества подготовки жестяных банок и крышек для продукции цехов, производящих продукты детского и диетического питания, а также жестяных банок и крышек линии кофе натурального растворимого и молотого.
Бактериологический анализ качества очистки жестяных банок и крышек проводят на присутствие бактерий группы кишечной палочки и общую бактериальную обсемененность. Для этого в обработанную банку наливают 50 см3 стерильной водопроводной воды, ополаскивают банку и высевают 1 см3 на чашку Петри для определения общей бактериальной обсемененности, а в 49 см3 добавляют 5 см3 концентрированной среды Эйкмана для выявления бактерий группы кишечной палочки.
Для определения общей бактериальной обсемененности и выявления бактерий группы кишечной палочки всю поверхность крышки, обращенную к банке, вытирают увлажненным тампоном.
После взятия пробы тампон помещают в пробирку с 10 см3 стерильной водопроводной воды, в этой же пробирке тампон увлажняли перед взятием пробы. 1 см3 подготовленной пробы высевают в чашку Петри для определения общей бактериальной обсемененности, а в пробирку добавляют 1 см3 концентрированной среды Эйкмана. Чашки Петри с посевами для определения общей бактериальной обсемененности заливают расплавленным и охлажденным до 45 °С СПА или МПА, содержащими 1% глюкозы. Посевы термостатируют при 37 °С в течение 24 ч.
Общая бактериальная обсемененность банок и крышек не должна превышать соответственно 500 и 100 микробных клеток.
Посевы в банках и пробирках со средой Эйкмана термостатируют при 43 °С в течение 48 ч.
Дальнейшее проведение анализа по выявлению бактерий группы кишечной палочки осуществляется по методике, изложенной в I разделе.
Жестяные банки и крышки, подготовленные для наполнения, не должны содержать бактерий группы кишечной палочки.
От каждой партии пакетов из полимерных материалов, используемых для упаковки продуктов детского и диетического питания, а также сухих завтраков, берется смыв из 3-х пакетов для определения общей бактериальной обсемененности.
В эту тару вливают 20 см3 стерильной водопроводной воды и после непродолжительного встряхивания (1-2 мин) делают посев 1 см3 смывной воды на МПА в 2 чашки Петри. Инкубируются посевы при температуре 37 °С в течение суток. Количество микроорганизмов во всем пакете устанавливается путем умножения полусуммы количества выросших колоний в 2-х чашках Петри на количество используемой для смыва воды.
Общая обсемененность полиэтиленовых пакетов не должна превышать 40 микробных клеток (внутренняя поверхность пакета 200-300 см2).
3. Контроль чистоты воздуха
В цехах, производящих продукты для детского и диетического питания, ежесменно должен производиться контроль чистоты воздуха.
Пробы отбираются седиментационным методом. Чашку с застывшей агаризованной средой МПА+1% глюкозы оставляют открытой в течение 10 мин. Затем чашку закрывают и термостатируют при 37 °С в течение 24 ч.
Показатели общей обсемененности в цехе детского и диетического питания не должны превышать 10-ти колоний в чашке при 10-минутной экспозиции, в расфасовочно-упаковочном отделении - 5-ти колоний в чашке при 10-минутной экспозиции.
4. Контроль чистоты рук
Бактериальную чистоту рук у каждого рабочего проверяют не менее 2 раз в месяц. Контроль производится перед началом работы, перед выходом на рабочее место.
Определение чистоты рук ведется методом смыва. При бактериологическом анализе смывов с рук в них определяется общая бактериальная обсемененность и наличие бактерий группы кишечной палочки.
Перед взятием пробы стерильный тампон увлажняют, погружая его в пробирку с 10 см3 стерильной водопроводной воды.
При взятии смывов с рук протирают увлажненным тампоном поверхности обеих рук, проводя не менее 5 раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевые пространства, ногти и подногтевые пространства.
После взятия пробы тампон помещают в пробирку, в которой увлажняли тампон. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, 1 см3 и 0,1 см3 подготовленной пробы высевают в чашки Петри. Посевы заливают расплавленным и охлажденным до 45 °С СПА или МПА, содержащими 1% глюкозы.
Результаты анализа учитывают через 24 ч после термостатирования при 37 °С. Количество микроорганизмов, обнаруженных на руках, не должно превышать 10000.
После высева 1 см3 и 0,1 см3 подготовленной пробы для определения общей бактериальной обсемененности в пробирку добавляют 1 см3 концентрированной среды Эйкмана для определения бактерий группы кишечной палочки и содержимое пробирки перемешивают. Посевы на среде Эйкмана термостатируют 48 ч при 43 °С. Через 48 ч из засеянных пробирок со средой Эйкмана, в которых наблюдается появление мути и газообразование или появление только одной мути, проводится посев на среду Эндо.
Дальнейшее проведение анализа и идентификация типичных для бактерий группы кишечной палочки колоний, выросших на среде Эндо, проводится по общепринятой схеме, описанной в 1 разделе.
При оценке данных следует исходить из требований отсутствия кишечной палочки.
При учете общей бактериальной обсемененности ориентировочно можно придерживаться следующей оценки:
|
Количество колоний, выросших при посеве 1 см3 смыва с рук |
Оценка |
|
1000 |
отлично |
|
1000-5000 |
хорошо |
|
5000-10000 |
удовлетворительно |
|
свыше 10000 |
плохо |
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Методика определения зараженности стен плесенями в цехах
по производству продуктов детского и диетического питания
Микробиологический анализ на зараженность плесенями проводится до и после дезинфекции.
Определение зараженности плесенями стен цехов производится методом соскоба. Этот метод состоит в определении количества колоний плесеней, вырастающих на сусло-агаре при высеве соскоба поверхностного слоя побелки. Соскоб берется скребком, представляющим собой металлический рубанок, стригущая часть которого выступает на 1 мм.
Простерилизованный обжиганием скребок прикладывают на уровне груди к стене цеха по вертикали таким образом, чтобы выступающая часть его (лезвие) вошло во всю глубину слоя побелки. Затем скребок продвигают вверх по стене примерно на 10 см. Соскабливаемый при этом слой побелки (соскоб) будет осыпаться в желоб скребка. Образцы отбираются в четырех местах помещения, и, таким образом, проба для анализа представляет соскоб с площади в 100 см2.
Соскоб помещают в стерильную широкогорлую колбу вместимостью 200-250 см3, куда наливают 100 см3 воды. Содержимое колбы немедленно тщательно перемешивают встряхиванием в течение 2 мин и затем тут же по 1 см3 взвеси высевают в каждую из трех параллельных чашек и заливают расплавленным и затем охлажденным до 40 °С сусло-агаром.
Показатель зараженности стен плесенями выражается числом зародышей на 1 см2 стены (среднее по трем чашкам).
Для получения результатов достаточно выдержать чашки при температуре 25±1 °С в течение 5 сут., ежедневно контролируя появление роста.
Дезинфекция считается удовлетворительной, если при анализе количество зародышей плесеней на 1 см2 поверхности составляет единицы.
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Приготовление питательных сред
Среды для определения общей бактериальной обсемененности
1. Мясо-пептонный бульон. Освобожденное от костей, жира и сухожилий говяжье или конское мясо пропускают через мясорубку и заливают холодной водопроводной водой из расчета 1 л воды на 500 г мяса. Смесь водопроводной воды с фаршем медленно нагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 часов. Небольшое количество (до 5 л) можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. Большое количество лучше кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности мясной воды фильтруют сначала небольшое количество ее в пробирку через бумажный фильтр, если жидкость прозрачная, вода готова. Затем жидкость сцеживают через полотно, сюда же отжимают сок из вареного мяса, доливают кипяченой водой до первоначального объема, разливают в чистую посуду (колбы, бутылки) и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С. Из полученной мясной воды готовят мясо-пептонный бульон. К 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона, 5 г NaCI, устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в чистую посуду и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С. В случае выпадения осадка в мясо-пептонном бульоне его вторично фильтруют с последующей стерилизацией.
2. Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону прибавляют 1,5% мелко нарезанного агара. Ставят на слабый огонь для растворения. Устанавливают реакцию до рН 7,0-7,2, кипятят 12-15 мин, фильтруют через вату, добавляют 1% глюкозы, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при температуре 120 °С в течение 20 мин.
3. Сухой питательный агар выпускается Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред.
Среды и реактивы для выявления бактерий кишечной группы
1. Концентрированная среда Эйкмана. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлористого натрия, смесь нагревают до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 см3 в пробирки. Среду стерилизуют текучим паром 30 мин, считая с момента когда термометр покажет температуру 100 °С. Стерилизация текучим паром должна производиться 3 дня подряд. В промежутках между стерилизациями среда должна находиться в помещении с температурой не ниже 16 °С.
2. Среда Эндо. 100 см3 мясо-пептонного агара (рН 7,4) расплавляют на водяной бане, охлаждают до 70 °С и прибавляют 1 г химически чистой лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве стерильной прокипяченной дистиллированной воде.
В отдельных пробирках приготовляют:
а) 2-3 см3 спиртового насыщенного раствора основного фуксина;
