Примітки:
(1) - необов'язкові дослідження. Можливість їх проведення залежить від матеріально-технічного забезпечення лабораторії (наявність обладнання для поліміразної ланцюгової реакції тощо);
(2) - обсяг досліджень визначає епідеміолог в залежності від епідемічної ситуації;
(3) - дослідження проводяться лише за епідпоказаннями.
При дослідженні стічної води перевага повинна надаватися каналізаційним колекторам, які обслуговують великі групи населення. Математично розрахована оптимальна група складає 100-300 тис. населення, яка обслуговується однією каналізаційною системою і дозволяє з високою ймовірністю виділити ентеровіруси при наявності поодиноких випадків ентеровірусних інфекцій. При меншій групі населення численні, відібрані у різні строки проби змішують, при більшій - збільшують частоту забору.
Окремим питанням є необхідність стандартизації вірусологічних методів, при яких використовуються перещеплювальні клітинні культури. Головними напрямками вирішення цієї проблеми є:
- забезпечення відповідної матеріально-технічної бази;
- оцінка придатності методик, яка проводиться виконавцем цих методик для підтвердження правильності виконання та вірогідності отриманих результатів. При оцінці придатності методик ураховується їх чутливість та специфічність;
- розробка стандартних операційних процедур щодо кожного виду дослідження на підставі яких можливе точне відтворення методик;
- наявність референс-штамів вірусів (для виконання певних методик, оцінки внутрішнього контролю якості, контролю чутливості клітинних культур). Найчастіше використовують вакцинні штами поліовірусу трьох типів;
- наявність мінімальної кількості клітинних культур (не менше 2 ліній) з централізованим забезпеченням ними лабораторій;
- належна система внутрішнього контролю якості (періодична перевірка правильності виконання досліджень персоналом лабораторії: паралельні дослідження певної проби, повторні дослідження певної проби чи дослідження експериментально контамінованого зразка) та зовнішнього забезпечення якості (професійні випробування), міжлабораторні порівняння.
При застосуванні у вірусологічній лабораторії для визначення ентеровірусів, крім класичного вірусологічного методу полімеразної ланцюгової реакції у разі позитивних результатів проби, необхідно також дослідити на клітинних культурах з метою виділення вірусу та подальшої його ідентифікації.
4. Довгострокове зберігання штамів ентеровірусів
На теперішній час, згідно з рекомендаціями ВООЗ, для виділення ентеровірусів використовується 2 лінії перещеплювальних клітинних культур - RD (клітини рабдоміосаркоми людини) та HEp-2 (клітини епідермоїдної карциноми людини). Обидві лінії клітинних культур є високочутливими до поліовірусу. Зазвичай, поліовірус та віруси Коксакі В добре розмножуються в клітинах HEp-2; поліовіруси, віруси ЕСНО багатьох типів, деякі віруси Коксакі A - у клітинах RD.
До колекції ентеровірусів музею патогенних для людини мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України входять 79 штамів ентеровірусів, ізольованих з проб фекалій, спинномозкової рідини (СМР), носопролигових змивів хворих та здорових осіб та об'єктів довкілля. Ізоляти виділені як в лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій, так і отримані з вірусологічних лабораторій обласних та міських СЕС.
Для виділення ентеровірусів із проб фекалій готують суспензію досліджуваного матеріалу із розрахунку 10 мл фосфатно-сольового буферу, 0,5 мл хлороформу та фекалій. Додають скляних бус і струшують протягом 20 хвилин. Після центрифугування протягом 20 хвилин при досліджують супернатант.
При дослідженні носопролигових змивів тампон вміщують у флакон з середовищем для транспортування, струшують, віджимають стерильним пінцетом та видаляють. У рідину, що залишилася, додають антибіотики із розрахунку 100 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину.
Для дослідження спинномозкової рідини її необхідно обробити антибіотиками.
Виділення вірусів проводять на пробірочних клітинних культурах за цитопатогенною дією, здійснюючи 2 пасажі матеріалу.
Штами ентеровірусів виділяли із застосуванням клітинних культур HEp-2 та RD. Ідентифікацію здійснювали в реакції вірус нейтралізації із застосуванням діагностичних ентеровірусних кролячих сироваток виробництва Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН.
Зазначені дослідження проводили макро- або мікрометодом.
При мікрометоді використовували мікротитрувальні панелі.
Діагностичні полі- або моновалентні сироватки змішували із близько
100 ТЦД50 досліджуваної вірусної суспензії. Якщо не проводили
попереднього титрування вірусу, то в дослідження брали його
-3 -4
розведення 10 та 10 . Однак у кожному досліді паралельно
проводили перевірочне титрування, що дозволяє розраховувати титр
вірусу при кожному дослідженні.
Серед штамів ентеровірусів, що на теперішній час знаходяться в колекції музею патогенних для людини мікроорганізмів, 8,9% (7 штамів) ідентифіковано як віруси Коксакі B-1, 36,7% (29 штамів) - віруси Коксакі B-3, 19,0% (15 штамів) - віруси Коксакі B-5, 10,1% - віруси ЕСНО-6 (8 штамів), 6,3% - віруси ЕСНО-30 (5 штамів), по 3,8% - віруси ЕСНО-7, -11, -13 (по 3 штами), по 1,3% віруси ЕСНО-3, -18, -19 та -25 (по 1 штаму) та 2,5% ідентифіковано як ентеровірус типу 70 (2 штами) (рис. 1).
Рис. 1. Питома вага енерговірусів різних типів, що входять
до колекції патогенних для людини мікроорганізмів
44,3% штамів ізольовано від інфекційних хворих, 29,1% - від здорових осіб, 26,6% - з об'єктів довкілля (рис. 2). Найчастіше віруси виділяли з проб фекалій - 79,3% (рис. 3).
Рис. 2. Питома вага штампів ентеровірусів, ізольованих
від інфекційних хворих, здорових осіб та об'єктів
довкілля
Рис. 3. Питома вага штампів ентеровірусів, виділених
з різного біоматеріалу
Крім вищезгаданих штамів ентеровірусів до колекції музею патогенних для людини мікроорганізмів входить штам ентеровірусу типу 71, отриманий нами в 1998 р. із музею штамів ентеровірусів Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН.
Штами зберігаються при температурі -70 град. C.
При необхідності роботи з певним вірусом його розморожують, накопичують на відповідній клітинній культурі, проводять підтверджуючу ідентифікацію.
Узагальнюючи матеріал, наведений у даному розділі, необхідно підкреслити наступне:
1. До колекції ентеровірусів музею патогенних для людини мікроорганізмів входить 79 штамів, які представлені наступними серотипами: вірусами Коксакі B-1, -3, -5, вірусами ЕСНО-3, -6, -7, -11, -13, -18, -19, -25, -30 та ентеровіруси типу 70 та 71.
2. Найбільш ефективним об'єктом дослідження щодо виділення ентеровірусів є проби фекалій. 79,3% штамів, що входять до колекції ентеровірусів, ізольовано саме з цього біоматеріалу.
3. Відновлення музейних штамів ентеровірусів із заморожуваного стану здійснюється шляхом культивування розморожених вірусів на чутливій перещеплювальній лінії клітин з обов'язковою підтверджуючою ідентифікацією за допомогою діагностичних моновалентних кролячих сироваток.
5. Структура епідеміологічного нагляду за ентеровірусними інфекціями Наукові та практичні стратегічні напрямки епідеміологічного нагляду за ентеровірусними інфекціями
Оптимізація вірусологічного моніторингу:
1. Визначення об'єктів дослідження.
2. Визначення обсягу досліджень.
3. Стандартизація методів.
4. Акредитація лабораторій.
5. Впровадження молекулярно-генетичних методів дослідження.
Підвищення ефективності оперативного аналізу:
1. Співпраця епідеміологів, інфекціоністів, педіатрів, дитячих неврологів, вірусологів.
2. Інформаційний зворотний зв'язок між зацікавленими спеціалістами всіх адміністративних рівнів.
Протиепідемічні та профілактичні заходи, спрямовані на:
1. Джерело інфекції
- своєчасне виявлення, ізоляція, лікування,
- диспансерний нагляд з метою запобігання розвитку соматичної патології,
- моніторинг циркуляції ентеровірусів серед здорового населення.
2. Фактори передачі збудника
- визначення оптимальних параметрів застосування нових дезінфекційних засобів,
- розробка нових методів знезараження стічної та питної води,
- моніторинг циркуляції ентеровірусів в об'єктах довкілля.
3. Сприйнятливий організм
- підтримка належного рівня охоплення щепленнями (поліомієліт),
- поступовий перехід на застосування лише інактивованої поліомієлітної вакцини,
- моніторинг стану популяційного імунітету (поліомієліт),
- розробка засобів неспецифічної профілактики.
Загалом структуру епідеміологічного нагляду за ентеровірусними інфекціями можна представити наступним чином (рис. 4).
Рис. 4. Схема епідеміологічного нагляду за ентеровірусними
інфекціями
Із сучасних позицій цілісна система епідеміологічного нагляду визначається як ряд послідовних, пов'язаних між собою підсистем:
інформаційної, аналітично-діагностичної та організаційно-виконавчої. Інформаційна підсистема є основним елементом епідеміологічного нагляду, яка забезпечує отримання даних щодо епідемічної ситуації і базується на результатах вірусологічних досліджень. Оцінка основних проявів епідемічного процесу, причин і умов його розвитку входить до функцій аналітично-діагностичної підсистеми. Контроль над активністю епідемічного процесу забезпечується належним функціонуванням організаційно-виконавчої підсистеми, що можливо лише за умов налагодженої роботи 2 інших підсистем.
В інформаційній підсистемі епідеміологічного нагляду за ентеровірусними інфекціями доцільно виділити діагностично значимі інформаційні потоки. 1-й потік характеризує епідемічний процес як результат взаємодії збудника і сприйнятливого організму. Цей потік несе інформацію щодо проявів епідемічного процесу ентеровірусних інфекцій на популяційному й організменному рівнях, сприйнятливості населення та біологічних властивостей популяції збудника. 2-й потік містить інформацію про фактори довкілля, що впливають на активність епідемічного процесу.
Ураховуючи велику кількість серотипів ентеровірусів, поліморфізм клінічних проявів ентеровірусних інфекцій, вплив заходів щодо ерадикації поліомієліту на їх епідемічний процес, здійснення епідеміологічного нагляду за ентеровірусними інфекціями не можливо без належного вірусологічного лабораторного забезпечення. Вірусологічний моніторинг ентеровірусних інфекцій є провідною складовою інформаційної підсистеми епідеміологічного нагляду за цими хворобами. Від його результативності залежить ефективність функціонування аналітично-діагностичної та організаційно-виконавчої підсистем. Велике значення має створення колекції ентеровірусів, її належне зберігання, що є запорукою для розвитку молекулярної епідеміології ентеровірусних інфекцій, прогнозування перебігу їх епідемічного процесу та розробки адекватних протиепідемічних та профілактичних заходів.
Директор Департаменту державного санітарно-епідеміологічного А.М.Пономаренконагляду
