Методичні рекомендації з лабораторної діагностики рикетсіозів

Таблиця 1

Схема титрування антигена

Титр антигена дорівнює 1:4

Таблиця 2

Схема титрування гемолітичної сироватки

Титр гемолітичної сироватки дорівнює 1:1200.

Еритроцити барана заготовляють заздалегідь. Кров, забрану з яремної вени барана, дефібринують у флаконах з скляними бусами шляхом струшування протягом 10-15 хв., проціджують через стерильну марлю і зберігають у рефрижераторі. Для зберігання еритроцити консервують за допомогою консерванту такого складу: борна кислота - , глюкоза - , фізіологічний розчин до 100 мл.

Розчин стерилізують кип'ятінням на водяній бані по 20 хвилин 3 дні підряд. Консервант додають до дефібринованої крові з розрахунку 15 мл на 100 мл крові. Консервовані таким способом еритроцити можна зберігати в рефрижераторі (4 град. С) протягом 2-3 місяців.

В день проведення досліду еритроцити відмивають фізіологічним розчином до зникнення ознак гемолізу центрифугуванням протягом 10-15 хвилин при 1500 об/хв; з осаду готують 1-3%-у суспензію еритроцитів у фізіологічному розчині.

Для виготовлення гемолітичної суміші (гемолітичної системи) беруть рівні об'єми суспензії еритроцитів (1-3%) і гемолітичної сироватки в розведенні, що дорівнює її потрійному титру (робочий титр). Змішані еритроцити і гемолітичну сироватку витримують в термостаті (37 град. С) протягом 30 хвилин для сенсибілізації.

Багаторічні спостереження, проведені Українським центром з рикетсіозів, показали, що при постановці РЗК (титрування комплементу, основний дослід) доцільно використовувати не 3%-у, а 2%-у і навіть 1%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи, що дозволяє при високій чіткості результатів реакції економити використання комплементу в 3,5 рази, а еритроцитів барана - в 3,75 разів.

Порядок постановки РЗК. Перед основним дослідом РЗК проводять титрування комплементу для визначення його робочої дози. Із основного розведення комплементу 1:10 в ряд пробірок розливають мікропіпеткою різні дози розведеного комплементу з інтервалом 0,01 мл. Далі в пробірки з комплементом додають фізіологічний розчин до об'єму 0,6 або 0,3 мл і гемолітичну систему, попередньо сенсибілізовану протягом 30 хвилин в термостаті (по 0,4 або 0,2 мл). Суміш після перемішування поміщають в термостат (37 град. С) на 30 хвилин і проводять облік результатів.

В таблиці 3 наведена схема титрування комплементу в загальному об'ємі реакції 1,0 та 0,5 мл.

Якщо титрування комплементу проводять в присутності антигена, то в кожну пробірку до комплементу спочатку додають відповідну кількість антигена (0,1 або 0,2 мл) в робочому розведенні, а об'єм доповнюють фізіологічним розчином. Суміш реагентів поміщають в термостат на 1 годину, після чого додають гемолітичну систему і через 30 хвилин інкубації в термостаті проводять облік результатів.

При використанні в досліді не одного, а декількох антигенів, титрування комплементу проводять в присутності всіх видів антигенів, після чого вибирають відповідні дози комплементу.

Таблиця 3

Схема титрування комплементу

Оцінка результатів титрування комплементу полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу: відсутність гемолізу (повна його затримка) оцінюється чотирма плюсами (4+); майже повна затримка (сліди гемолізу) позначається трьома плюсами (3+); часткова затримка гемолізу позначається двома плюсами (2+), сліди затримки (майже повний гемоліз) - одним плюсом (1+). За одиницю комплементу приймають найменшу його кількість, яка викликає повний гемоліз еритроцитів. В наведеному прикладі ця одиниця дорівнює 0,06 мл комплементу, розведеного 1:10. За повну одиницю приймають другу пробірку з повним гемолізом, в наведеному прикладі - 0,07 мл. Робоча доза комплементу дорівнює кількості його, що відповідає одній повній одиниці комплементу - при проведенні зв'язування в термостаті при 37 град. С протягом однієї години, або двом повним одиницям - при проведенні зв'язування при температурі 4 град. С протягом 16-20 годин. В наведеному прикладі робоча доза комплементу при "гарячому" способі зв'язування дорівнює 0,07 мл, розведеного 1:10, на кожну пробірку, при холодному - 0,14 мл (0,07 x 2 = 0,14). Розрахунок кількості комплементу проводять на загальну кількість пробірок в досліді.

Якщо в роботі виявляється серія комплементу з високою активністю та при використанні гемолітичної системи з 1%-ї або 2%-ї суспензії еритроцитів, комплемент можна титрувати в основному розведенні не 1:10, а 1:20; в основному досліді використовують комплемент також в розведені 1:20.

Постановка основного досліду

Перший етап реакції. Досліджувані сироватки, попередньо інактивовані (56 град. С протягом 30 хвилин), розводять в ряд пробірок в межах 1:10-1:320 і більше (можна починати з 1:5) фізіологічним розчином в об'ємі 0,2 мл. До різних розведень сироваток додають по 0,2 мл антигена і 0,2 мл комплементу в робочій дозі.

Кожний дослід повинен супроводжуватись такими контролями:

1) Контроль усіх досліджуваних сироваток: 0,2 мл сироватки в початковому розведенні + 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,2 мл фізіологічного розчину;

2) Контроль антигена: 0,2 мл антигена + 0,2 мл комплементу в робочій + 0,2 мл фізіологічного розчину;

3) Контроль комплементу: 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,4 мл фізіологічного розчину;

4) Контроль гемолітичної системи: 0,6 мл фізіологічного розчину.

Після додавання усіх інгредієнтів суміш в пробірках старанно перемішують і поміщають в термостат при 37 град. С на 1 годину або при "холодному зв'язуванні" - в рефрижератор при 4 град. С на 16-20 годин.

Другий етап реакції. У всі пробірки після одногодинної експозиції в термостаті або зберігання 16-20 годин в рефрижераторі додають по 0,4 мл гемолітичної системи (попередньо сенсибілізованої протягом 30 хвилин в термостаті). Пробірки старанно струшують і поміщають в термостат (37 град. С) на 20-30 хвилин - до проходження гемолізу у всіх контролях, окрім контролю гемолітичної системи.

Облік результатів проводять через одну годину витримування пробірок при кімнатній температурі. Оцінка основного досліду, як і при титруванні комплементу, полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу в пробірках з досліджуваними сироватками у порівнянні з відповідними контролями, в яких виник повний гемоліз. Титром сироватки вважають максимальне розведення її, в якому спостерігається затримка гемолізу не менше ніж на 3+ при шкалі оцінки результатів на 4+.

Результати реакції вважають достовірними, якщо в контролях досліджуваних сироваток, антигена і комплементу спостерігається повний гемоліз, а в контролі гемолітичної системи гемоліз відсутній. Для контролю якості інгредієнтів і виконання реакції рекомендується паралельно ставити РЗК з явно позитивною (до її титру) та негативною сироватками. РЗК вважається позитивною з розведення сироватки 1:5-1:10. Схема проведення РЗК в об'ємі 1,0 мл наведена в таблиці 4.

З метою економії препаратів можна виконувати РЗК в загальному об'ємі 0,5 мл (табл.5), а також використовувати 1%-у або 2%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи. Такі модифікації не впливають на кінцевий результат реакції, якщо будуть дотримані однакові умови титрування комплементу і постановки основного досліду РЗК.

Таблиця 4

Схема постановки основного досліду РЗК в об'ємі 1,0 мл