Таблиця 1
Схема титрування антигена
-------------------------------------------------------------------
| Ряд |Інгредієнти, | Розведення антигена | Контролі |
| про-| мл |----------------------------+----------------|
|бірок| | Не |1:2 | 1:4 |1:8 |1:16 |сирова-|компле- |
| | |розве-| | | | | тки |менту |
| | |дений | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 1 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Сироватка | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| |специфічна | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| | | | | | 0,2 | 0,4 |
| |розчин | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 2 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Сироватка | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| |неспецифічна | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| | | | | | 0,2 | 0,4 |
| |розчин | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 3 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |розчин | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| |Поміщають на 1 годину в термостат (37 град. С) |
| |Додають гемолітичну систему по 0,4 мл з 1-3% еритроцитів |
| |Поміщають в термостат (37 град.С) на 30 хвилин |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| |Облік результатів: |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| 1 |Специфічна | ++++ |++++| +++ | + | - | - | - |
| |сироватка | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 2 |Неспецифічна | - | - | - | - | - | - | - |
| |сироватка | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 3 |Без сироватки| - | - | - | - | - | - | - |
-------------------------------------------------------------------
Титр антигена дорівнює 1:4
Таблиця 2
Схема титрування гемолітичної сироватки
---------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення гемолітичної сироватки |
|мл |-----------------------------------------------------|
| |1:600|1:900|1:1200|1:1500|1:1800|1:2100|1:2400|1:3000|
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Гемолітична | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|сироватка | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Суспензія | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|еритроцитів | | | | | | | | |
|барана (1-3%)| | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Комплемент в | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|розведенні | | | | | | | | |
|1:10 | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Фізіологічний| 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |0,4 |
|розчин | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Оцінка | - | - | - | ++ | +++ | ++++ | ++++ |++++ |
|результатів | | | | | | | | |
---------------------------------------------------------------------
Титр гемолітичної сироватки дорівнює 1:1200.
Еритроцити барана заготовляють заздалегідь. Кров, забрану з яремної вени барана, дефібринують у флаконах з скляними бусами шляхом струшування протягом 10-15 хв., проціджують через стерильну марлю і зберігають у рефрижераторі. Для зберігання еритроцити консервують за допомогою консерванту такого складу: борна кислота - , глюкоза - , фізіологічний розчин до 100 мл.
Розчин стерилізують кип'ятінням на водяній бані по 20 хвилин 3 дні підряд. Консервант додають до дефібринованої крові з розрахунку 15 мл на 100 мл крові. Консервовані таким способом еритроцити можна зберігати в рефрижераторі (4 град. С) протягом 2-3 місяців.
В день проведення досліду еритроцити відмивають фізіологічним розчином до зникнення ознак гемолізу центрифугуванням протягом 10-15 хвилин при 1500 об/хв; з осаду готують 1-3%-у суспензію еритроцитів у фізіологічному розчині.
Для виготовлення гемолітичної суміші (гемолітичної системи) беруть рівні об'єми суспензії еритроцитів (1-3%) і гемолітичної сироватки в розведенні, що дорівнює її потрійному титру (робочий титр). Змішані еритроцити і гемолітичну сироватку витримують в термостаті (37 град. С) протягом 30 хвилин для сенсибілізації.
Багаторічні спостереження, проведені Українським центром з рикетсіозів, показали, що при постановці РЗК (титрування комплементу, основний дослід) доцільно використовувати не 3%-у, а 2%-у і навіть 1%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи, що дозволяє при високій чіткості результатів реакції економити використання комплементу в 3,5 рази, а еритроцитів барана - в 3,75 разів.
Порядок постановки РЗК. Перед основним дослідом РЗК проводять титрування комплементу для визначення його робочої дози. Із основного розведення комплементу 1:10 в ряд пробірок розливають мікропіпеткою різні дози розведеного комплементу з інтервалом 0,01 мл. Далі в пробірки з комплементом додають фізіологічний розчин до об'єму 0,6 або 0,3 мл і гемолітичну систему, попередньо сенсибілізовану протягом 30 хвилин в термостаті (по 0,4 або 0,2 мл). Суміш після перемішування поміщають в термостат (37 град. С) на 30 хвилин і проводять облік результатів.
В таблиці 3 наведена схема титрування комплементу в загальному об'ємі реакції 1,0 та 0,5 мл.
Якщо титрування комплементу проводять в присутності антигена, то в кожну пробірку до комплементу спочатку додають відповідну кількість антигена (0,1 або 0,2 мл) в робочому розведенні, а об'єм доповнюють фізіологічним розчином. Суміш реагентів поміщають в термостат на 1 годину, після чого додають гемолітичну систему і через 30 хвилин інкубації в термостаті проводять облік результатів.
При використанні в досліді не одного, а декількох антигенів, титрування комплементу проводять в присутності всіх видів антигенів, після чого вибирають відповідні дози комплементу.
Таблиця 3
Схема титрування комплементу
------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, мл | N пробірок |
| |-----------------------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|----------------------------------------------------------------|
| Об'єм реакції 1,0 мл |
|----------------------------------------------------------------|
|Комплемент в |0,03|0,04|0,05|0,06|0,07|0,08|0,09|0,10| 0,11 |
|розведенні 1:10 | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Фізіологічний |0,57|0,56|0,55|0,54|0,53|0,52|0,51|0,50| 0,49 |
|розчин | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Гемолітична |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |
|система | | | | | | | | | |
|(1% еритроцити +| | | | | | | | | |
|гемолітична | | | | | | | | | |
|сироватка) | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Облік |++++|++++| ++ | - | - | - | - | - | - |
|результатів | | | | | | | | | |
|----------------------------------------------------------------|
| Об'єм реакції 0,5 мл |
|----------------------------------------------------------------|
|Комплемент в |0,03|0,04|0,05|0,06|0,07|0,08|0,09|0,10| 0,11 |
|розведенні 1:10 | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Фізіологічний |0,27|0,26|0,25|0,24|0,23|0,22|0,21|0,20| 0,19 |
|розчин | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Гемолітична |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |
|система | | | | | | | | | |
|(1% еритроцити +| | | | | | | | | |
|гемолітична | | | | | | | | | |
|сироватка) | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Облік |++++|+++ | + | - | - | - | - | - | - |
|результатів | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
Оцінка результатів титрування комплементу полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу: відсутність гемолізу (повна його затримка) оцінюється чотирма плюсами (4+); майже повна затримка (сліди гемолізу) позначається трьома плюсами (3+); часткова затримка гемолізу позначається двома плюсами (2+), сліди затримки (майже повний гемоліз) - одним плюсом (1+). За одиницю комплементу приймають найменшу його кількість, яка викликає повний гемоліз еритроцитів. В наведеному прикладі ця одиниця дорівнює 0,06 мл комплементу, розведеного 1:10. За повну одиницю приймають другу пробірку з повним гемолізом, в наведеному прикладі - 0,07 мл. Робоча доза комплементу дорівнює кількості його, що відповідає одній повній одиниці комплементу - при проведенні зв'язування в термостаті при 37 град. С протягом однієї години, або двом повним одиницям - при проведенні зв'язування при температурі 4 град. С протягом 16-20 годин. В наведеному прикладі робоча доза комплементу при "гарячому" способі зв'язування дорівнює 0,07 мл, розведеного 1:10, на кожну пробірку, при холодному - 0,14 мл (0,07 x 2 = 0,14). Розрахунок кількості комплементу проводять на загальну кількість пробірок в досліді.
Якщо в роботі виявляється серія комплементу з високою активністю та при використанні гемолітичної системи з 1%-ї або 2%-ї суспензії еритроцитів, комплемент можна титрувати в основному розведенні не 1:10, а 1:20; в основному досліді використовують комплемент також в розведені 1:20.
Постановка основного досліду
Перший етап реакції. Досліджувані сироватки, попередньо інактивовані (56 град. С протягом 30 хвилин), розводять в ряд пробірок в межах 1:10-1:320 і більше (можна починати з 1:5) фізіологічним розчином в об'ємі 0,2 мл. До різних розведень сироваток додають по 0,2 мл антигена і 0,2 мл комплементу в робочій дозі.
Кожний дослід повинен супроводжуватись такими контролями:
1) Контроль усіх досліджуваних сироваток: 0,2 мл сироватки в початковому розведенні + 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,2 мл фізіологічного розчину;
2) Контроль антигена: 0,2 мл антигена + 0,2 мл комплементу в робочій + 0,2 мл фізіологічного розчину;
3) Контроль комплементу: 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,4 мл фізіологічного розчину;
4) Контроль гемолітичної системи: 0,6 мл фізіологічного розчину.
Після додавання усіх інгредієнтів суміш в пробірках старанно перемішують і поміщають в термостат при 37 град. С на 1 годину або при "холодному зв'язуванні" - в рефрижератор при 4 град. С на 16-20 годин.
Другий етап реакції. У всі пробірки після одногодинної експозиції в термостаті або зберігання 16-20 годин в рефрижераторі додають по 0,4 мл гемолітичної системи (попередньо сенсибілізованої протягом 30 хвилин в термостаті). Пробірки старанно струшують і поміщають в термостат (37 град. С) на 20-30 хвилин - до проходження гемолізу у всіх контролях, окрім контролю гемолітичної системи.
Облік результатів проводять через одну годину витримування пробірок при кімнатній температурі. Оцінка основного досліду, як і при титруванні комплементу, полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу в пробірках з досліджуваними сироватками у порівнянні з відповідними контролями, в яких виник повний гемоліз. Титром сироватки вважають максимальне розведення її, в якому спостерігається затримка гемолізу не менше ніж на 3+ при шкалі оцінки результатів на 4+.
Результати реакції вважають достовірними, якщо в контролях досліджуваних сироваток, антигена і комплементу спостерігається повний гемоліз, а в контролі гемолітичної системи гемоліз відсутній. Для контролю якості інгредієнтів і виконання реакції рекомендується паралельно ставити РЗК з явно позитивною (до її титру) та негативною сироватками. РЗК вважається позитивною з розведення сироватки 1:5-1:10. Схема проведення РЗК в об'ємі 1,0 мл наведена в таблиці 4.
З метою економії препаратів можна виконувати РЗК в загальному об'ємі 0,5 мл (табл.5), а також використовувати 1%-у або 2%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи. Такі модифікації не впливають на кінцевий результат реакції, якщо будуть дотримані однакові умови титрування комплементу і постановки основного досліду РЗК.
Таблиця 4
Схема постановки основного досліду РЗК в об'ємі 1,0 мл
---------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контролі |
| мл |-------------------------------+---------------------------|
| |1:10|1:20|1:40|1:80|1:160|1:320|сиро-|Анти-|компле-|гемолі-|
| | | | | | | |автки|гена |менту |тичної |
| | | | | | | | | | |системи|
|-------------------------------------------------------------------------|
| Перший етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Сироватка |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 | | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Антиген |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | |0,2 | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Комплемент |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 |0,2 | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | 0,2 |0,2 |0,4 | 0,6 |
