Страница 4: ГОСТ 11293-89. Желатин. Технические условия (71124)

Вся посуда для бактериологического анализа перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена. Пробирки должны быть закрыты ватными пробками и завернуты в бумагу; горлышки колб и флаконов закрывают ватной пробкой, а сверху — бумажным колпач­ком, который обвязывают ниткой.

Пробки для пробирок и колб готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.

Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или заверты­вают в бумагу.

В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помещают в металлические пеналы от 6 до 10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.

Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в течение 2 ч в сушильном шкафу при (160+5) "С. При отсутствии сушильною шкафа посуду стерилизуют в течение 30 мин в автоклаве при (126±2) °С.

Стерильную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60 °С и хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.

Говяжье или конское мясо освобождают от костей, жира и сухо­жилий, измельчают на мясорубке и заливают холодной водой из расчета 1000 см³ воды на 500 г мяса. Смесь воды с измельченным мясом медленно нагревают до кипения и кипятят в течение 1,5 ч. Небольшое количество смеси (до 5 дм³) допускается кипятить на открытом огне при частом помешивании во избежание пригорания частичек мяса. Большое количество смеси следует кипятить в котлах с паровой рубашкой. Для определения готовности мясной воды сначала фильтруют небольшое количество смеси в пробирку через бумажный фильтр. Если жидкость прозрачная — вода готова.

Затем жидкость и весь сок из вареного мяса отжимают через ткань, доводят кипяченой водой до объема 1000 см³, разливают в чистую посуду (колбы, бутыли) и стерилизуют в течение 20 мин в автоклаве при (120,0±0,5) °С.

К 1000 см³ мясной воды, приготовленной по п. 4.24.2.2, добавляют 10 г сухого пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят в течение 30 мин, после этого уровень доводят кипяченой водой до первона­чального объема и фильтруют через бумажный фильтр. Затем среду нейтрализуют насыщенным раствором двууглекислого натрия или раствором с массовой долей гидроокиси натрия 10 %, устанавливая 7,0—7,2 ед. pH и стерилизуют при (120,0±0,5) °С в течение 15— 20 мин. Если после стерилизации в мясопептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют при том же режиме стерилизации.

К 1000 см³ приготовленного мясопептонного бульона перед сте­рилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

К 1000 см³ мясопептонного бульона, приготовленного по п. 4.24.2.3, перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения. Мясопептонный агар, охлажденный до 50—55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см³ мясопептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы.

Горячий мясопептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают 7,0—7,4 ед. pH. Разливают во флаконы и пробирки и в течение 20 мин стерилизуют в автоклаве при (120,0±0,5) °С.

К 100 см³ дистиллированной воды добавляют 5 г порошка агара, тщательно размешивают и кипятят на слабом огне до полного расплавления агара в закрытой посуде при периодическом помеши­вании во избежание пригорания, фильтруют, разливают в пробирки или флаконы и в течение 20 мин стерилизуют при (12О,О±О,5) °С.

1 г генциана фиолетового или кристаллвиолета растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 см³ этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помеши­вании 100 см³ дистиллированной воды. Сливают в колбу, оставляют на сутки, затем фильтруют.

2 г йодистого калия растворяют в 10 см³ дистиллированной воды. Затем 1 г кристаллического йода растирают в мелкий порошок, при помешивании добавляют раствор йодистого калия. Когда полностью растворится йод, добавляют дистиллированной воды до 300 см³.

спиртового раствора

8—9 г основного фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см³ этилового спирта и ставят на 18—24 ч в термостат с температурой (37±1) °С, флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть красителя растворяется, и на дне фла­кона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.

Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла.

Из насыщенного спиртового раствора готовят фуксинспиртовод- ный раствор. Для этого к 1 см³ насыщенного спиртового раствора прибавляют 9 см³ дистиллированной воды.

8,5 г хлористого натрия растворяют в 1000 см³ питьевой воды. Стерилизуют при (120,0±0,5) °С в течение 20 мин.

Среду готовят непосредственно в лаборатории следующим обра­зом. В колбу вместимостью 1000 см³ вносят 10 г пептона, 5 г лактозы, 5 г хлористого натрия, 1 см³ спиртового раствора с массовой долей розоловой кислоты 5 % и 2,5 см³ раствора.с массовой долей метиле­нового синего 0,1 %, заливают 1000 см³ питьевой воды и нагревают до кипения.

Среду разливают в пробирки с поплавками по 10 см³ и стерили­зуют в течение 15 мин в автоклаве при (110±2)°С или в течение 20 мин в аппарате Коха или в кипящей водяной бане.

Среда должна быть нейтральной в пределах 7,4—7,6 ед. pH. При использовании новой партии пептона в первом приготовлении среды до добавления красителя устанавливают объем щелочи, который необходимо добавить для достижения 7,4—7,6 ед. pH, используя раствор гидроокиси натрия концентрации 0,1 моль/дм³. При после­дующих приготовлениях ориентируются лишь на цвет среды, для чего рекомендуется при первом приготовлении отбирать и хранить обра­зец-эталон цвета.

Примечание. Для нейтрализации 1 г семипалатинского пептона требуется от 0,5 до 0,8 см³ раствора гидроокиси натрия с концентрацией 0,1 моль/дм³.

Порошок розоловой кислоты массой 0,5 г насыпают в маленький флакончик с притертой пробкой или резиновой пробкой и заливают 10 см³ этилового спирта. Раствором можно пользоваться на следую­щие сутки в течение месяца.

0,1 г метиленовой сини заливают 100 см³ дистиллированной воды, затем выдерживают сутки в термостате при температуре 37—40 °С. Срок пользования раствором не ограничен.

Для каждого из индикаторов нужно иметь отдельную пипетку, продетую через пробку, которой закрыт пустой флакон. После отмери­вания раствора пипетку не моют и выставляют обратно в пустой флакон.

20 г желатина, взятого из средней пробы, помещают в колбу и заливают 180 см³ стерильной питьевой воды или физиологического раствора, затем оставляют набухать при 5—10 °С в течение 1,0—1,5 ч. Колбу с набухшим желатином помещают в водяную баню, нагретую до (40±2) °С, выдерживают в ней до полного растворения желатина. Затем в колбу помещают стерильный магнит и ставят на магнитную мешалку, нагретую до (38±2) °С, и перемешивают в течение 5— 10 мин. Магнит стерилизуют кипячением в колбе в течение 15— 20 мин.

10 см³ приготовленного раствора содержат 1 г желатина (разведе­ние 10^-1).

Для проведения бактериологических анализов готовят следующие разведения.

Разведение 1 : 100 или 10^-2. Стерильной пипеткой набирают 1 см³ основного раствора, приготовленного по п. 4.24.2.12 (разведение 10“¹), и вносят в пробирку с 9 см³ стерильной питьевой воды или физиологического раствора.

Разведение 1 : 1000 или 10^-3. Второй стерильной пипеткой тща­тельно перемешивают содержимое пробирки с разведением 10~², набирая в пипетку раствор и выдувая его, повторяя эту процедуру 8—10 раз. Затем 1 см³ полученного раствора отбирают этой же пи­петкой и переносят в следующую пробирку с 9 см³ воды.

Воду или физиологический раствор, используемые для разведе­ний, подогревают до 36—40 °С.

Метод основан на способности определяемых микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при (30±1) °С в течение (72±3) ч.

По 1 см³ раствора желатина вносят параллельно в две стерильные чашки Петри из каждого приготовленного разведения. Если анали­зируемый материал начинают засевать с первого разведения, то для каждого разведения используют новую пипетку, а если начинают засевать с последнего разведения, то используют одну пипетку. Затем в чашки Петри с анализируемым материалом заливают по 15 см³ расплавленного и охлажденного до 45—50 °С мясопептонного агара. Содержимое чашек тщательно перемешивают вращательными дви­жениями, после застывания агара их помещают (вверх дном) в термостат при (30±1) °С в течение (72±3) ч.

Для подсчета колоний выбирают чашки Петри с изолированными колониями.

Подсчет общего количества КОЕ в 1 г желатина производят в одной чашке Петри (Х₅) по формуле

Х₅= п • 10

где п — количество колоний, подсчитанное в чашке Петри;

Л| — степень разведения.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифме­тическое значение двух результатов подсчета одного разведения.

Метод основан на способности бактерий группы кишечных пало­чек (колиформных) в среде Хейфеца расщеплять лактозу, вследствие чего выделяются газы и образуются кислые продукты, изменяющие цвет индикатора.

Из приготовленных выше разведений берут по 1 см³ раствора и засевают в две пробирки, содержащие по 5 см³ среды Хейфеца. Посевы термостатируют при (37,0±0,5) °С в течение 13—16 ч.

Колиформные бактерии вызывают помутнение среды, изменение ее окраски из красно-фиолетовой на желтую и образование газа в поплавках. При остывании среда приобретает зеленоватый оттенок.

Когда цвет недостаточно яркий или мутность слабая, или газооб­разование слабо выражено, из пробирки рекомендуется отлить 1— 2 см³ среды в белую фарфоровую чашку и добавить одну-две капли индикатора метилового красного (0,1 г метилового красного, 62 см³ спирта и 38 см³ дистиллированной воды).

Появление устойчивой малиновой или кирпично-красной окрас­ки через 1—2 мин указывает на наличие колиформных бактерий.

При отсутствии колиформных бактерий в разведении 10^-2 жела­тин соответствует требованиям стандарта.

Определение наличия патогенных микроорганизмов проводят по методам, утвержденным Министерством здравоохранения СССР.

Сущность метода заключается в специфическом росте желатин- разжижаюших бактерий на желатине, которые продуцируют и выделяют в среду протеолитический фермент — желатиназу, рас­щепляющий белок желатина, вследствие чего отмечается его раз­жижение.

По 10 см³ раствора желатина, приготовленного по п. 4.24.2.12, вносят в две чашки Петри. Желатин распределяют по дну чашки легкими вращательными движениями и выдерживают в термостате при (24±1) °С в течение 48 ч. Колонии желатинразжижающих бакте­рий имеют вид маленьких прозрачных пузырьков за счет разжижения желатина. При выдерживании чашек с желатином более четырех суток колонии увеличиваются. При наклоне чашки на месте колонии желатин сползает.

Обнаруженные на желатине колонии желатинразжижающих бак­терий подсчитывают в каждой чашке Петри.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифме­тическое значение двух результатов подсчета.

2. 25. При проведении испытаний допускается применение реак­тивов, аппаратуры и лабораторной посуды, с характеристиками не ниже указанных.

3. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

   1. Транспортирование

Желатин транспортируют всеми видами транспорта в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами перевозок гру­зов, действующими на данном виде транспорта.