Биологическая эффективность заключается в способности устройства отбирать частицы, несущие микроорганизмы. По ряду причин, таких как выживаемость микроорганизмов, при отборе проб, и по способности питательной среды поддерживать их рост, биологическая эффективность может быть ниже физической. Метод испытаний, изложенный в настоящем приложении, в основном, касается физической эффективности.
В.2. Экспериментальный метод
В.2 1 Камера для проведения испытаний
Обычно используется камера шириной и высотой 1м и длиной 2м. Однако может использоваться любое небольшое замкнутое пространство. Тест-аэрозоль может генерироваться либо внутри камеры, либо подаваться в нее извне. В контролируемую зону должен подаваться воздух, прошедший через НЕРА фильтр, причем в этой зоне должно поддерживаться отрицательное давление за счет вытяжки воздуха с определенной скоростью. Удаляемый воздух должен проходить через НЕРА фильтр.
Поток воздуха должен быть неоднонаправленным, а кратность воздухообмена должна быть равной кратности воздухообмена в чистом помещении (как правило, она составляет от 20 до 60ч-1). Чтобы избежать локального повышения концентрации загрязнений в воздухе, следует должным образом обеспечить приток и вытяжку воздуха. Эффективным решением является устройство притока и вытяжки воздуха таким образом, чтобы внутри камеры поддерживались отрицательное давление воздуха и его циркуляция (например, с помощью вентилятора).
Для контроля эффективности циркуляции воздуха внутри камеры и концентрации частиц в нем следует использовать счетчик частиц, выполняющий также функцию отбора проб воздуха из камеры.
Следует поддерживать температуру (22±2)°С и относительную влажность (50±10)%. Должна быть предусмотрена возможность управления оборудованием, находящимся внутри камеры, с внешней ее стороны, например, за счет использования вмонтированных в камеру перчаток или полукостюмов.
В.2.2. Тест-штаммы микроорганизмов
В.2.2.1. Штаммы для определения физической эффективности
Следует использовать тест-штамм Bacillus subtilis var. niger NCTC10073 (DSM 2277), который хорошо выживает в условиях отбора проб. Штамм следует готовить на питательной среде, отвечающей установленным требованиям, и использовать в виде отмытой суспензии спор.
Примечание: Для определения физической эффективности устройств для отбора проб воздуха могут использоваться сферические частицы полистирола и другие виды нежизнеспособных частиц [13]. Результат будет аналогичен результату, полученному с использованием микроорганизмов. Однако некоторые устройства для отбора проб воздуха не позволяют выявить все нежизнеспособные частицы, в то время как микроорганизмы прорастают в колонию, которая может быть легко обнаружена и подсчитана.
В.2.2.2. Штаммы для определения биологической активности
Источником появления в воздухе помещений многих видов микроорганизмов могут быть кожные покровы персонала, на которых доминируют микроорганизмы коагулаза - отрицательные стафилококки.
Однако в некоторых помещениях может быть обнаружено значительное число микроорганизмов, причиной появления которых является технологический процесс. При проведении биологических испытаний следует использовать микроорганизмы, которые обычно встречаются в чистых помещениях. Можно использовать такой тест-микроорганизм как Staphylococcus epidermidls (NCTC 11047, АТСС 14990). Однако следует иметь в виду, что изменения состава распыляемого аэрозоля, метода распыления и условий отбора проб могут привести к изменению биологической эффективности устройств для отбора проб воздуха. В связи с этим метод определения биологической эффективности может быть менее надежен, чем метод определения физической эффективности.
В.2.3. Генерация частиц - носителей микроорганизмов
Аэрозоли, состоящие из частиц определенного размера, генерируются с помощью устройств различных типов (например, таких как дисковые генераторы аэрозолей) [14]. На диск, вращающийся с высокой частотой, подается жидкая суспензия микроорганизмов, которая при этом превращается в мелкодисперсный гомогенный аэрозоль. Изменяя частоту вращения, можно получить капли различного размера. Капли быстро высыхают, и в зависимости от количества нерастворимого материала в жидкости можно получить сухие частицы различных размеров. Диаметр капель можно определить с помощью уравнения, которое связывает его с плотностью и поверхностным натяжением жидкости, частотой вращения и диаметром диска распылителя. Кроме того, диаметр капель можно измерить при помощи микроскопа.
Размеры частиц, содержащих влагу, уменьшаются за счет ее испарения до размеров, которые зависят от их твердой фазы. Их размеры и массу можно увеличить, вводя в суспензию микроорганизмов йодид калия. Диаметр сухой частицы можно вычислить, пользуясь нижеприведенными уравнениями, или определить при помощи микроскопа путем отбора проб воздуха в камере с использованием мембранного фильтра
Радиус r любой частицы связан с объемом К следующей формулой
r =(3/4 π V)1/3 (В.1)
Размер сухой частицы зависит от количества твердого материала, имеющегося в частице, содержащей влагу, и от размера споры.
Следовательно, радиус сухой частицы равен
(В.2)
где Vs- объем споры (примерно 0,5 мкм3);
Vp- объем частицы после испарения.
(В.3)
Определив радиус сухой частицы, легко вычислить ее диаметр.
Аэродинамическое поведение частицы зависит от ее плотности. Поэтому необходимо определить эквивалентный диаметр сухой частицы, т.е. размер сухой частицы для случая, если бы ее плотность была равна единице. Эквивалентный диаметр частицы dэ рассчитывается по формуле
dэ = d(ρ)1/2, (В.4)
где d- диаметр сухой частицы, мкм;
р - плотность твердого вещества, из которого состоит частица, г/мкм3.
В.2.4. Проведение испытаний
Испытания проводятся в камере или в помещении, где созданы условия турбулентности, аналогичные тем, что имеются в чистом помещении. Устройство для отбора проб воздуха и фильтродержатель, в котором расположен фильтр с порами диаметром 0,45мкм, должны быть помещены рядом, но на достаточно большом расстоянии от генератора аэрозолей (примерно 1м). Это нужно для того, чтобы частицы к моменту отбора пробы были сухими. С помощью счетчика частиц следует определить, что концентрация частиц около устройства для отбора проб воздуха и фильтродержателя одинакова. Мембранное устройство для отбора проб воздуха, работающее со скоростью потока (отбора пробы) примерно 5л/мин, не должно быть обращено фильтром вверх. Фильтр должен быть направлен только в сторону или вниз, чтобы предотвратить осаждение частиц на мембрану под действием сил гравитации. Оба устройства включаются одновременно. Время отбора проб зависит от концентрации жизнеспособных микроорганизмов в воздухе, однако считается, что достаточно несколько минут. После испытания фильтры помещаются в чашки, содержащие соевый казеино-пептонный агар или эквивалентную аттестованную среду. После инкубации обоих наборов проб в течение 2сут. при температуре 37°С подсчитывается число колоний.
Перед испытаниями готовится суспензия отмытых спор в растворе 80%-ного этилового спирта с концентрацией не более 106-107 спор/мл, что позволяет получить частицы, несущие, в основном, только одну спору. Необходимое количество генерируемого аэрозоля зависит от размеров камеры и объема подаваемого и удаляемого воздуха. При изменении концентрации аэрозоля не следует увеличивать время отбора проб, а также необходимо следить, чтобы на питательной среде не было совмещений (совпадений) колоний микроорганизмов.
В аэрозольной среде следует диспергировать твердые вещества в различных концентрациях для того, чтобы при распылении получить частицы различных размеров. Необходимая концентрация твердых веществ определяется по формулам В.1-В.4. Для получения диапазона частиц диаметром от 0,8 до 15мкм следует приготовить пять растворов. Для частиц каждого диаметра следует провести не менее 10 экспериментов.
В.3. Оформление результатов
Эффективность устройства для отбора проб в процентах определяется по известному числу колоний в этом устройстве и числу колоний в устройстве с мембранным фильтром по следующей формуле при условии, что объемы проб воздуха для обоих устройств равны.
(В.5)
Результаты можно выразить графически в виде кривой, отражающей зависимость эффективности устройства для отбора проб воздуха от размеров частиц. Все точки представляют собой средние значения эффективности с указанием стандартных отклонений.
С.1. Введение
В настоящем приложении приведены методы определения биозагрязнений на поверхностях для случаев, когда предусмотрено проведение микробиологического контроля. С целью обнаружения жизнеспособных частиц отбираются представительные пробы, которые являются предметом контроля.
Эти методы не выявляют общее число жизнеспособных микроорганизмов, но позволяют получать относительные результаты, пригодные для сравнения в контролируемых условиях. Методы могут использоваться при текущем контроле чистых помещений в эксплуатируемом состоянии, а также, при необходимости, в построенном и оснащенном состояниях.
Настоящий стандарт предусматривает организацию документированной системы контроля биозагрязнений в чистых помещениях.
С.2 Общие положения
Количество микроорганизмов на поверхности подсчитывается контактным методом или при помощи тампонов. Контактный метод заключается в том, что твердую питательную среду известной площади прикладывают к контролируемой поверхности и затем инкубируют. Проросшие колонии являются зеркальным отражением («картой») жизнеспособных микроорганизмов, имеющихся на поверхности. Можно использовать тампоны, которыми проводят по поверхности, а затем подсчитывают число микроорганизмов, собранных ими.
Скорость осаждения микроорганизмов на поверхность определяется следующим образом. Питательная среда с известной площадью выдерживается в течение определенного времени, а затем инкубируется. По количеству проросших колоний определяется скорость осаждения микроорганизмов на поверхность в данный промежуток времени.
С.3 Устройство для отбора проб
С.3.1 Контактные устройства для отбора проб
Могут использоваться контактные пластины или другие устройства, в которых питательная среда помещена в твердые или эластичные контейнеры. Среда соприкасается с контролируемой поверхностью. Площадь поверхности должна быть не менее 20см2.
Контакт среды с поверхностью должен происходить в течение нескольких секунд при постоянном и однородном давлении на всю поверхность без вращательных и поступательных движений. Затем контактное устройство помещается обратно в контейнер, а контролируемая поверхность очищается от остатков питательной среды.
С.3.2 Тампоны
Жизнеспособные единицы также можно отбирать тампонами. Стерильные увлажненные тампоны, губки или салфетки особенно удобны при отборе проб с больших, негигроскопичных, неровных поверхностей, имеющих углубления, недоступные для контактных устройств.
Тампон предварительно должен быть смочен стерильной средой.
Пробы отбираются медленными движениями тампона параллельными близко расположенными линиями. Затем операция повторяется движениями тампона перпендикулярными линиями по отношению к первым. После этого тампон помещается в определенное количество среды для извлечения микроорганизмов, которое им же перемешивается. Среда, используемая для извлечения, должна анализироваться на наличие жизнеспособных частиц. Поверхность, с которой отобрали пробу, следует очистить, удалив остатки смывающей среды.
С.3.3. Седиментационные чашки
Седиментационные чашки могут использоваться для количественной и качественной оценки возможного загрязнения поверхности жизнеспособными микроорганизмами, оседающими из воздуха.
Число частиц, несущих микроорганизмы и оседающих из воздуха на поверхность в определенный промежуток времени, можно определить при помощи седиментационных чашек, наполненных питательной средой. Чашки затем инкубируют. Этот метод не позволяет определить общее число микроорганизмов в воздухе. Он дает число микроорганизмов, осевших на поверхность в течение времени отбора пробы. Чувствительность этого метода можно повысить, если использовать большие чашки Петри (например, диаметром 14см) и увеличить время экспозиции. При этом следует принять меры против высыхания питательной среды [15].
С.4. Оформление результатов
Уровень жизнеспособных частиц на поверхностях выражается числом жизнеспособных единиц на 1дм2 или числом жизнеспособных единиц на 1дм2/ч (для метода седиментационных чашек).
D.1. Введение
В настоящем приложении приведены методы определения биозагрязнений тканей для случаев, когда предусмотрено проведение микробиологического контроля. С целью обнаружения жизнеспособных частиц в тканях отбираются представительные пробы, которые являются предметом контроля.
Настоящий стандарт предусматривает организацию документированной системы контроля биозагрязнений в чистых помещениях.
Ткани, применяемые в зонах риска, должны иметь надлежащую чистоту, соответствующую виду выполняемой работы и/или цели использования. Следует выполнять контроль биозагрязнения тканей с целью сведения к минимуму их отрицательного влияния на вид деятельности, продукцию, оборудование в зонах риска.
При выборе тканей и оценке их свойств нужно учитывать следующие факторы, влияющие на уровень биозагрязнений в зонах риска:
a) тип и назначение тканей, например, ткань для технологической одежды, салфеток;
