---

15,0 г сухого порошка готовой среды растворяют в колбе в 1 дм холодной дистиллированной воды, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают в пробирки столбиком 10-12 см. Стерилизуют 20 мин при температуре 110 °С. рН среды после стерилизации 7,0±0,2, цвет - фиолетовый.

Применяют для определения анаэробной ферментации глюкозы.

3.2.7. Среда с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом, выпускаемая Дагестанским НИИ питательных сред.

Состав среды на 1 дм , г:

15,0 г сухого порошка готовой среды растворяют в колбе в 1 дм холодной дистиллированной воды, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания, фильтруют, разливают в пробирки по 5-6 см . Стерилизуют 20 мин при температуре 110 °С. рН среды после стерилизации 7,0±0,2, цвет - фиолетовый.

Применяют для определения биохимических свойств.

3.2.8. Пептонную среду с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.

Применяют для определения способности В. cereus образовывать ацетилметилкарбинол.

3.2.9. Нитратная среда

К 1 дм мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1, добавляют 1,0 г калия азотнокислого. Среду разливают по 5 см в пробирки и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение 15 мин.

Среду хранят при температуре 0-5 °С не более 1 мес.

Применяют для определения нитратредуцирующих свойств.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Выделение характерных колоний

4.1.1. Для проведения испытания отбирают объем 0,1-0,2 см подготовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости.

Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей на поверхность питательной среды.

4.1.2. Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают поверхностным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри с предварительно подсушенной селективной средой, указанной в пп.3.2.1-3.2.3 или 3.2.4.

4.1.3. Посевы на чашках Петри термостатируют при (30±1) °С в течение 24-48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных для В. cereus. Характеристика колоний В. cereus на селективных питательных средах приведена в приложении.

Через 48 ч уточняют число обнаруженных колоний. Корректировку подсчета количества В. cereus проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных для В. cereus.

4.2. Подтверждение принадлежности характерных колоний к В. cereus.

4.2.1. Для подтверждения принадлежности подсчитанных колоний к колониям, образуемым В. cereus, микроорганизмы из пяти колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют 18-24 ч при (30±1) °С.

На скошенном мясо-пептонном агаре В. cereus образует сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью. Со скошенного мясо-пептонного агара готовят препараты, окрашивают по Граму по ГОСТ 30425, а также определяют подвижность клеток при микроскопировании методом висячей капли.

В мазках, приготовленных со скошенного агара, В. cereus имеет вид крупных грамположительных палочек размером 1,0-1,2x3,0-5,0 мкм со слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже отдельно друг от друга. В. cereus образует субтерминальные или центральные споры. В висячей капле клетки подвижны, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью.

4.2.2. Для доказательства анаэробной ферментации глюкозы культуры со скошенного агара, указанного в п.4.2.1, высевают уколом в питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой (см. п.3.2.6). Посевы инкубируют при температуре (30±1) °С в течение 24 ч. В. cereus растет, окрашивая среду в желтый или желто-коричневый цвет по всей длине укола.

4.2.3. Для определения способности В. cereus ферментировать маннит культуры со скошенного агара (см. п.4.2.1) пересевают на питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом (см. п.3.2.7). Посевы термостатируют при (30±1) °С в течение 24 ч.

При развитии В. cereus на среде с маннитом цвет среды не изменяется.

4.2.4. Для постановки реакции на образование ацетилметилкарбинола культуры со скошенного агара (см. п.4.2.1) пересевают на пептонную среду с глюкозой с рН 7,0. Посевы термостатируют при (30±1) °С в течение 24 ч. В чистую пробирку отбирают 1 см культуры, добавляют 0,2 см раствора гидроокиси калия массовой концентрацией 400 г/дм и 0,6 см свежеприготовленного по ГОСТ 10444.1 раствора 1-нафтола и несколько кристаллов креатина. Допускается реакцию на образование ацетилметилкарбинола проводить без применения креатина.

После добавления каждого раствора содержимое пробирки тщательно встряхивают, а затем оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

В. cereus образует ацетилметилкарбинол, поэтому окраска среды меняется в розовый цвет.

При отрицательной реакции культуральную жидкость термостатируют дополнительно 24 ч, после чего делают окончательное заключение.

4.2.5. При постановке реакции на подтверждение редукции В. cereus нитратов предварительно убеждаются в том, что сама среда не содержит нитритов. Для этого в две контрольные пробирки со средой добавляют по 0,2-0,5 см смеси равных объемов растворов, как указано в пп.3.1.4, 3.1.5. Если в течение 15 мин не происходит покраснения среды, то среду используют для определения нитрат-редуцирующей способности микроорганизмов.

Допускается использование йодокрахмального реактива по ГОСТ 10444.1 для контроля отсутствия нитритов в питательной среде.

Для подтверждения редукции нитратов проводят посевы в пробирки с нитратной средой. Посевы термостатируют при температуре (30±1) °С в течение 24 ч, затем добавляют 0,2-0,5 см смеси равных объемов растворов по пп.3.1.4, 3.1.5.

Если в течение 15 мин не происходит покраснения, добавляют в посев немного порошкообразного цинка и выдерживают еще 10 мин. Если после добавления цинка среда краснеет, то редукция нитратов, вследствие отсутствия В. cereus, не произошла и тест считают отрицательным. Если после добавления цинка среда не краснеет, то делают вывод о том, что редукция нитратов, вследствие присутствия В. cereus, произошла.

Допускается вместо смеси равных объемов растворов, указанных в пп.3.1.4, 3.1.5, использовать растворы, указанные в пп.3.1.6, 3.1.7.

В этом случае эти растворы добавляют из расчета по две капли каждого раствора к 3 см культуральной жидкости.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из колоний, обнаружены подвижные, грамположительные, нитратредуцирующие, спорообразующие палочки, способные образовывать ацетилметилкарбинол, ферментировать в анаэробных условиях глюкозу и не способные ферментировать маннит, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относятся к В. cereus.

5.3. При необходимости подсчета В. cereus, если в 80% случаев, т.е. не менее чем в четырех из пяти колоний, подтвержден рост В. cereus, то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к В. cereus.

В остальных случаях количество В. cereus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохимических свойств.

5.4. Результаты испытаний пересчитывают на 1 г или 1 см продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Справочное

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ В. CEREUS НА СЕЛЕКТИВНЫХ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Текст документа сверен по:

официальное издание

Консервы. Методы микробиологического анализа:

Сб. ГОСТов. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002