Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробах питної води надана у табл. 6.3.

Таблиця 6.3.

Схема концентрації вірусів ГГМКК у пробі питної води

Етап

Матеріал

Обробка

Тривалістьетапу

Адсорбціявірусів наГГМКК

Проба питноїводи ()післядехлорування

- Додати р-н HCl дорН 5,0;- Додати ГГМКК- Струшувати автоматично10-20 хв. або вручну до5 хв.- Відстоюванняпри кімнатнійтемпературі 14-18 годин- Надосад обережно злитичерез край- Надосад в подальшійроботіне використовувати!

До 20 год.

Нещільнийбілий осадпіслявідстоюваннявпродовж14-18 год(200 мл)

- Центрифугувати при1000 об./хв. впродовж10-20 хв.- Відібрати надосадНадосад в подальшійроботіне використовувати!

До 30 хв.

Нещільнийбілий осадпісляцентри-фугування(20 мл)

- Струшувати впродовж4-5 хв. і перенестив 2 центрифужніпробірки;- Центрифугувати при2000-3000 об./хв.впродовж 10-20 хв.- Відібрати надосад- Надосад в подальшійроботіне використовувати!

До 30 хв.

Елюціявірусів зГГМКК

Осад післяцентри-фугування

- Додати 2,0 мл у кожнупробірку трис-буферу (рН 8,4);- Струсити та залишитипри кімнатнійтемпературі впродовж4-5 хв.;- Центрифугуватипри 2000-3000 об./хв.впродовж 10-20 хв.;- Відібрати надосад -елюат (4 мл)

До 30 хв.

Елюат (4 мл) направляють для подальшогодослідження

Загальнізатрати часудо 24 год.

5.4. Концентрація вірусів за допомогою бентоніту

20

50

ріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 207 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.

7.4. Дослідження проб на наявність віруса гепатиту А

7.4.1. Визначення вірусних антигенів ВГА в ІФА

Елюати, отримані після концентрування досліджуваних об'ємів води, аналізуються методом ІФА у відповідності до Інструкціїї, що додається до стандартного комерційного діагностичного набору, зареєстрованого в Україні.

7.4.2. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією

Для проведення дослідження рекомендовано використовувати сертифіковані тест-системи.

Для проведення аналізу використовуються проби води без додаткової концентрації або концентрат (елюат). Зразок у кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.

Проби зберігають при 2-8 град. С не більше одної доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.

Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.

Проведення аналізу

ПЛР-аналіз складається з чотирьох етапів, кожний з яких має свої контрольні зразки:

- виділення РНК;

- отримання комплементарной ДНК (кДНК) на матриці РНК - реакція зворотної транскрипції (ЗТ);

- ампліфікація ділянки ДНК - полимеразная ланцюгова реакція (ПЛР);

- електрофоретический аналіз продуктів ПЛР і облік результатів ПЛР-аналізу.

Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу)

Порядок роботи

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ HAV-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином та ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ HAV-rec).

4. Щільно закриті проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.

10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбента. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.

Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.

Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації).

Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)

Порядок роботи

При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальну маркіровку "RNase-free", "DNase-free".

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.

5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.

7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).

Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С протягом тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.

Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)

У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР

1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.

2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.

3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

Порядок роботи

1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.

Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.

Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.

2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).

3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3). Проби після ампліфікації можна берегти 16 годин при кімнатній температурі, протягом тижня при 2-8 град. С.

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації)

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в нкремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

Порядок роботи

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищений спеціальною маскою або скляною пластиною!

Облік результатів

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.

Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:

- вірусу гепатиту А (HAV) - 430 п.н.

- внутрішнього контролю (ВКЗ) - 680 п.н.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 430 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 680 п.н. (табл. 8.6.)

Таблиця 8.6.

Оцінка результатів аналізу контрольних зразків

Контрольнийзразок

Контрольованийетап ПЛР-аналізу

Специфічні смуги наелектрофореграмі

Смуга 430 п.н.

Смуга 680 п.н.

"ПК"

Виділення РНК

Є

Є

"НК"

Виділення РНК

Ні

Є

"К-"

ПЛР

Ні

Ні

"К+"

ПЛР

Є

Ні

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 680 п.н.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 430 п.н., що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 430 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК.

6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 680 п.н. більшої або меншої інтенсивності

7. Окрім смуг 430 п.н. і 680 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наприведеними в табл. 8.6., то відповідний етап аналізу слід переробити.

2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 430 п.н. і 680 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.

3. У доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 430 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходи по виявленню джерела контамінації.

8. Методи дослідження проб на наявність кишкових фагів