Трахеальний цитотоксин являє собою фрагмент пептидоглікана клітинної стінки бордетел, який також може пошкоджувати епітеліальні клітини.
Дермонекротизуючий токсин має судинозвужуючу активність, але його роль у розвитку захворювання залишається неясною.
Білки зовнішньої мембрани, ліпополісахарид також належать до факторів патогенності бордетел і відіграють не аби-яку роль в патогенезі захворювання.
Усі ці фактори патогенності притаманні свіжовиділеним штамам, але при зберіганні на поживних середовищах вірулентність та імуногенність поступово зменшуються, змінюються культуральні та біологічні властивості мікроорганізма.
Адсорбовані монорецепторні сироватки до видових антигенів (аглютиногенів) 1, 14 і 12 використовують для диференціації видів у представників роду Bordetella.
Специфічними монорецепторнимі сироватки до антигенів (аглютиногенів), позначеним цифрами 1, 2, 3 розрізняють серовари збудника кашлюку за допомогою реакції аглютинації на склі. Методика постановки реакції аглютинації викладена в додатку до стандартних діагностичних сироваток. Характеристика різних властивостей мікробів роду Bordetella викладена в додатку №1.
3. Показання до лабораторного обстеження
3.1. Лабораторна діагностика кашлюку і паракашлюку може здійснюватись трьома методами: бактеріологічним, при якому виділяють збудника зі слизу задньої стінки глотки; серологічним, при якому визначають специфічні антитіла в сироватці хворого або особи, що перехворіла та виявлення антигенів у полімеразній ланцюговій реакції. Бактеріологічний метод обстеження та ПЛР є методами ранньої діагностики захворювань, серологічний - використовують для ретроспективного встановлення діагнозу.
3.2. Бактеріологічне обстеження проводять з діагностичною метою і за епідеміологічними показами.
З діагностичною метою обстежують:
1) дітей і дорослих з підозрою на кашлюк і подібні до кашлюку захворювання за клінічними ознаками;
2) дітей, що знаходяться в дитячих дошкільно-шкільних організаціях, у тому числі закритого типу, а також у пологових будинках, дитячих лікарнях, санаторіях, що кашляють протягом 5-7 днів і більше, незалежно від вказівок на контакт із хворим на кашлюк і паракашлюк;
3) дорослих, що працюють з дітьми в зазначених вище організаціях, які кашляють протягом 5-7 і більше днів незалежно від вказівок на контакт із хворим на кашлюк і паракашлюк;
4) реконвалесцентів перед випискою у закриті дитячі установи, стаціонари і санаторії (не раніше 2-3 днів після завершення прийому антибіотиків).
3.3. За епідемічними показами обстежують осіб, які спілкувалися з хворими на кашлюк і паракашлюк:
1) дітей і персонал дитячих дошкільних, дитячих оздоровчих установ, початкових класів шкіл, пологових будинків, дитячих лікарень, санаторіїв при спілкуванні з хворим в організації;
2) дітей до 7 років і дорослих, які працюють в зазначених вище дитячих установах, при спілкуванні з хворим на кашлюк у домашніх умовах;
3) обстеження проводять дворазово на 2-4 тижнях від початку кашлю в першого хворого у вогнищі.
4. Лабораторна діагностика
4.1. Основним методом лабораторної діагностики є бактеріологічний, при якому проводиться посів досліджуваного матеріалу на оптимальні поживні середовища і виділення чистої культури з наступною ідентифікацією збудника. Бактеріологічне дослідження з діагностичною метою варто проводити в ранній термін захворювання (але не пізніше 3-ого тижня) дворазово щодня або через день, тому що в більш пізній термін висіваність збудника різко знижується. Необхідність обстеження в дитячих організаціях і його терміни встановлює епідеміолог.
4.2. Матеріалом для дослідження є слиз з верхніх дихальних шляхів, що осідає при кашлі на задній стінці глотки. Взяття матеріалу здійснюють натще або через 2 години після прийому їжі до початку антибактеріальної терапії. Для посіву матеріалу краще використовувати казеїново-вугільний агар з доданням 5% крові коня або барана (використання крові людини дає гірші результати) та пеніциліну. Метод інформативний у ранній термін захворювання: до другого тижня періоду спазматичного кашлю.
4.3. Мікроби роду Bordetella дуже вимогливі щодо поживних середовищ і умов вирощування. Висіваність їх залежить від наступних факторів:
1) терміну бактеріологічного обстеження (кращої висіваності досягають при обстеженні хворих протягом 2 тижнів від початку хвороби, а при обстеженні контактних - до 3 - 4 тижнів від початку захворювання першого хворого);
2) кратності обстеження (при повторних обстеженнях, проведених з короткими інтервалами, імовірність висіву значно збільшується);
3) додержання правил узяття і посіву матеріалу;
4) якості тампонів (використовують тільки спеціальні м’які ватні тампони; не можна їх замінювати тампонами, що застосовуються для забору матеріалу на дифтерію);
5) термінів і умов доставки матеріалу в лабораторію (при транспортуванні слід оберігати матеріал від прямих сонячних променів і низької температури, посіви поміщають у спеціальні термоконтейнери, бікси з захисною прокладкою — марлевими ватниками, грілками) Оптимальною температурою для тривалого транспортування становить 4оС, при 25оС суттєво знижується процент позитивних результатів культурального дослідження;
6) якості поживних середовищ. В даний час доцільним вважають зменшити в 3 рази кількість пеніциліну, що додається в агар, або замінити пеніцилін на цефалексин, останній у дозі 40 мг на 1дм3 середовища, іноді може бути використаний амфотерицин у дозі 50 мг на 1дм3 для пригнічення грибкової флори.
4.4. Забір матеріалу може проводитись 2 способами - задньоглоточним тампоном і «кашлевими пластинками»:
1) задньоглоточним тампоном матеріал забирають як з діагностичною метою, так і за епідемічними показами. У немовлят матеріал забирають тільки тампоном;
2) забір матеріалу задньоглоточним тампоном проводить спеціально призначений і інструктований персонал: медичні сестри дитячих поліклінік і дитячих установ, помічники епідеміологів, лаборанти. Матеріал беруть у дитячих поліклініках у спеціально виділених приміщеннях, що виключають контакт з іншими дітьми, а також у дитячих установах і вдома. При заборі матеріалу повинна бути цілком виключена можливість взаємного зараження обстежуваних;
3) для підвищення імовірності знахідки збудника матеріал відбирають 2 тампонами, попередньо вигнутими під тупим кутом (до стерилізації): сухим і зволоженим. Сухий тампон служить для провокації кашлю, а зволожений - для безпосереднього взяття виділень. Матеріал із сухого тампона засівають на чашки з середовищем КВА обов’язково на місці його взяття, а зволожений - сіють в лабораторії. Матеріал доставляють в лабораторію не пізніше 2-4 годин після взяття; Методика забору матеріалу сухим і зволоженим тампонами однакова і зводиться до наступного. Медичний працівник лівою рукою фіксує за допомогою шпателя корінь язика, а правою - вводить тампон у порожнину рота, просуваючи його за корінь язика. Тампон не повинен торкатися слизової оболонки щік, язика і мигдалин. Кінчиком тампона й опуклою його частиною торкаються задньої стінки глотки, проводячи по ній з права наліво 2-3 рази, потім також обережно над шпателем витягають тампон з порожнини рота. Якщо дитина виявляє ознаки занепокоєння, то помічник, який знаходиться за його спиною фіксує голову позаду.
4.5. Метод “кашлевих пластинок” використовують тільки з діагностичною метою при наявності кашлю. Узяття матеріалу проводить медичний персонал.
Збір матеріалу проводять на 2 чашки з поживним середовищем. Для цього під час кашлю знімають кришку з чашки Петрі, підносять чашку із середовищем до рота особи, яка кашляє, на відстані 10- і тримають протягом 5-6 кашлевих поштовхів так, щоб крапельки слизу з дихальних шляхів потрапили на поверхню середовища. При нетривалому покахикуванні можна цю ж чашку піднести повторно. Необхідно стежити, щоб на поживне середовище не потрапила слина, блювотні маси, мокротиння. Чашку з поживним середовищем закривають кришкою і доставляють у лабораторію.
4.6. При посіві матеріалу з діагностичною метою рекомендується використовувати 2 чашки із середовищем, а за епідемічними показами - 1 чашку.
4.7. Інкубацію здійснюють при температурі 35оС в умовах підвищеної концентрації СО2 та підвищеної вологості.
4.8.Іншим методом виділення збудника є імунофлюоресцентний, який може бути використаний при наявності якісних реагентів та кваліфікованого персоналу.
4.9.Сучасним і перспективним методом діагностики є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Чутливість методу становить декілька бактерій у пробі, специфічність біля 100 %, при негативних культуральних дослідженнях ПЛР виявляється позитивною у 71% випадків.
4.10. Виявляти антигени В.pertussis у клінічному матеріалі можна за допомогою ІФА. Одним із варіантів цього метода є визначення кашлюкового токсину. З цією метою використовуються очищені специфічні антитіла до токсину.
5. Доставка матеріалу й оформлення направлення
5.1.Забір, зберігання та доставка зразків до лабораторії проводиться з дотриманням правил асептики і біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом (ДСП 9.9.5.-080–2002).
5.2. Матеріал на зволожених тампонах і посіви матеріалу негайно доставляють в лабораторію (не пізніше 2-4 годин після узяття).
При транспортуванні варто оберігати матеріал від прямих сонячних променів, зберігаючи його в температурних межах від +4 до +370С, для чого рекомендується поміщати його в спеціальні термоконтейнери або бікси з захищаючою прокладкою (марлеві ватники, грілки). На матеріал, що надсилають до лабораторії, оформлюють направлення за формою 204/0, де додатково вказують: 1) кількість обстежень; 2) метод узяття матеріалу.
6. Бактеріологічний метод дослідження
6.1. Бактеріологічний метод дослідження передбачає виділення збудника шляхом посіву на щільні поживні середовища, виділення чистої культури й ідентифікацію збудників роду Bordetella до виду. Дослідження продовжується протягом 5-7 днів.
6.2. Перший день дослідження:
1) посів матеріалу, узятого тампоном, проводять послідовно на 1-2 чашки з поживним середовищем, що попередньо оброблене пеніциліном, цефалексином або амфотерицином для пригнічення супутньої мікрофлори (при узятті матеріалу “кашлевими пластинками” середовище антибіотиками не обробляють). Обробку антибіотиками можна проводити двома способами: шляхом нанесення їх на поверхню поживного середовища або шляхом додавання в середовище (додаток №2). Для одержання ізольованих колоній, посів матеріалу роблять ретельно втираючи його тампоном спочатку на периферії середовища у вигляді 4-5 бляшок, а потім Z - подібним штрихом у центрі чашки. Та ж методика посіву застосовується на другій чашці. Стерильним шпателем розтирають центральні частини посіву, не торкаючись бляшок.
Посів матеріалу також можна робити в такий спосіб: на половину чашки Петрі матеріал засівається площадкою, потім розсівається на третій і четвертий сектори;
2) засіяні чашки (тампоном або “кашлеві пластинки”) поміщають у термостат при температурі 35-37°С на 3 доби (72 години). Для зволоження повітря в термостат ставлять посудину з водою;
3) як поживне середовище для посіву досліджуваного матеріалу застосовують середовища, що містять кров: картопляно-гліцериновий агар (середовище Борде-Жангу) і молочно-кров'яний агар або середовища без крові: казеїново-вугільний агар (КУА). Середовища можуть бути приготовлені безпосередньо в лабораторіях (Додаток №3) або придбані.
6.3. Четвертий день дослідження (3 доба, 72 години):
1) переглядають посіви на чашках з поживним з середовищем з метою відбору підозрілих колоній роду Bordetella. Перегляд колоній роблять за допомогою бінокулярного стереоскопічного мікроскопа або бінокулярної лупи з великою фокусною відстанню (типу БМ-51-2);
2) колонії мікробів роду Bordetella при рості на поживних середовищах опуклі, вологі, гладкі, блискучі з рівними краями, сірого кольору з блакитнуватим, перлинним або металевим, а іноді жовтуватим або білуватим відтінком. Колонії всіх трьох видів Bordetella мають м’яку (маслянисту) консистенцію і легко знімаються. При перегляді колоній у стереоскопічному мікроскопі можна спостерігати вузький промінь світла (“хвостик”), що відходить від її центру. Колонії B.bronchiseptica в субкультурі можуть бути двох видів: подібні до кашлюкових і більш плоскі або з піднятим центром.
Терміни появи колоній різні: колонії B.bronchiseptica з’являються через 18-24 години, В. parapertussis - через 24-48 годин і В. pertussis - через 48-72 години. Різна швидкість росту відбивається на величині колоній при перегляді їх через 72 години (див. таблицю). На середовищах із кров’ю навколо колоній майже завжди утворюється зона слабкого гемолізу;
3) В. parapertussis при рясному рості на середовищі КВА викликають дифузне забарвлення середовища в бурувато-коричневий колір, що виявляється при перегляді в проходячому світлі, а також викликають потемніння середовища з кров’ю. Ріст В.pertussis і B.bronchiseptica на поживному середовищі не супроводжується зміною його кольору;
4) при виявленні на середовищі підозрілих колоній виділяють чисту культуру, шляхом відсівання їх на скошений КВА або в чашки Петрі з одним з поживних середовищ. При цьому поверхню середовища ділять на кілька секторів і відсівають кожну колонію на окремий сектор, ретельно втираючи її в середовище круговими рухами;
5) при наявності значної кількості однотипних підозрілих колоній, крім виділення чистої культури, з колоній, що залишилися, роблять мазки, визначають морфологічні та тинкторіальні властивості культури при фарбуванні за Грамом. Одночасно виявляють і відсутність спонтанної аглютинації. Мікроби роду Bordetella мають вигляд мономорфних дрібних овоїдних паличок (кокобактерій), рівномірно розташованих в мазку, грамнегативні. Іноді В.parapertussis, особливо з середовища Борде-Жангу, можуть мати вигляд подовжених поліморфних паличок. Культуру з колоній, що залишилися, перевіряють у реакції аглютинації на склі зі специфічними видовими неадсорбованими сироватками, розведеними 1:10 і по можливості з адсорбованими монорецепторними сироватками до аглютиногенів (факторів) 1 і 14.
