Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред

Целевые микроорганизмы должны оцениваться в 2 балла и иметь типичный внешний вид, размер и морфологию колоний. Рост нецелевых микроорганизмов должен быть частично или полностью ингибирован (0 или 1).

5.4 Методы, применяемые в отношении жидких культуральных сред

Для определения производительности жидкой среды необходимо использовать подходящий иноку­лят. Количественный, полуколичественный и качественный методы, описанные ниже, позволяют оценить производительность и селективность. Предлагаемые методы регистрируют степень роста после надлежа­щей инкубации путем культивирования или штрихового посева из жидких сред на агаровые среды и под­счета колониеобразующих единиц (КОЕ) или вычисления баллов для жидкой среды. В случае качествен­ных методов для жидких сред характеристические реакции оценивают визуально.

Данный метод также пригоден для оценивания новых культуральных сред или разбавителей.

Отбирают нужное число пробирок или порций по 10 см³ каждой партии испытуемой жидкой среды.

Инокуляция целевых микроорганизмов: инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон, ис­пользуя каждый тест-микроорганизм с малым содержанием (например, от 10 до 100 КОЕ в каждой пробир­ке; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.

Инокуляция нецелевых микроорганизмов: инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон, ис­пользуя каждый тест-микроорганизм с более высоким содержанием (>1000 КОЕ в каждой пробирке; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.

Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов как смешанной культуры: для испытаний сме­шанных культур в селективных средах инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон малым коли­чеством целевых микроорганизмов (например, от 10 до 100 КОЕ на каждую пробирку; о приготовлении инокулята см. 5.2.1) и в ту же пробирку вносят значительное количество нецелевых микроорганизмов (> 1000 КОЕ в каждую пробирку; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.

Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов в разбавителях и транспортных средах: инокули­руют разбавители тест-микроорганизмами (например, от 100 до 1000 КОЕ в каждую пробирку; о приготов­лении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.

Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.

Разбавители должны инкубироваться в течение 45 мин при комнатной температуре и затем быть раз­литы по чашкам. Транспортные среды должны инкубироваться при соответствующей температуре и нуж­ное время в соответствии с обычным использованием и затем быть разлиты по чашкам.

Берут аликвотный объем или, при необходимости, разбавление каждого бульона после инкубации и распределяют в чашке с неингибирующим агаром, как это описано в 5.3.1.

Примечание — Для испытаний смешанных культур необходимо проводить распределение, когда это возможно, на чашках с неселективным агаром, которое позволяет достичь дифференциации микроорга­низмов в смешанной культуре (например, для подсчета видов Escherichia coll и Salmonella используется агар для чашечного подсчета с MUG). В случае, когда невозможно различить смешанные культуры на неселектив­ном агаре, следует использовать среды с селективным агаром при условии, что были предварительно испытаны их эксплуатационные характеристики.

После инкубации проводят подсчет колоний целевых и нецелевых микроорганизмов в случае, если в смешанных культурах можно различить разные типы. Расчеты и интерпретацию следует проводить с уче­том цели исследования:

^сравнительная интерпретация между эталонным и испытуемым бульонами, используя значения P_R и S_F, как это описано в 4.2.3.2 и 4.2.3.3:

• для целевых микроорганизмов P_R не должен быть <0,1 (разница в росте не превышает одного порядка величины);

• для нецелевых микроорганизмов S_F должен достигать по меньшей мере 2;

2. в смешанных культурах рост целевых микроорганизмов не должен ингибироваться нецелевыми микроорганизмами, т. е. целевые микроорганизмы должны всегда быть доминирующей популяцией;в других случаях, когда достигается фиксированное минимальное количество целевых микроорга­низмов и максимальное количество нецелевых микроорганизмов, более уместно, что:

- содержание целевых микроорганизмов должно достигать от 10⁶ КОЕ/см³ до 10⁸ КОЕ/см³;

-содержание нецелевых микроорганизмов не должно превышать 10⁴ КОЕ/см³ в селективном бульоне;

2. в случае разбавителей и транспортных сред не требуется ни пониженное, ни повышенное количе­ство целевых и/или нецелевых микроорганизмов. Число микроорганизмов после инкубации в данных сре­дах должно быть в пределах ± 50 % исходного количества.

Примечание — Качество жидкой среды в плане свойств оптимального роста проявляется наиболее обстоятельно на ранней стадии роста. Анализ продолжительности лог-фазы и роста в начале лог-фазы дает наиболее точную информацию относительно производительности и селективности целевых и нецелевых микроорганизмов соответственно в испытуемом и эталонном бульонах. Таким образом, если пытаются обнаружить только минимальные различия в качестве сред, следует провести посев штрихом из жидких сред в чашках после сокращенного периода инкубации продолжительностью, например, 6 или 12 ч.

Отбирают нужное количество пробирок или порций по 10 мл каждой испытуемой партии.

Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов как смешанной культуры: инокулируют одну про­бирку испытуемого бульона примерно от 10 до 100 КОЕ целевых микроорганизмов и в ту же пробирку инокулируют повышенное число нецелевых микроорганизмов (> 1000 КОЕ на каждую пробирку), и переме­шивают.

Инокуляция нецелевых микроорганизмов: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона микро­организмами с повышенным содержанием (> 1000 КОЕ) и перемешивают.

Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.

Отбирают 10 мкл смешанной культуры и проводят посев штрихом в чашке с конкретной селективной средой для целевых микроорганизмов.

Отбирают одну петлю (10 мкл) культуры нецелевых микроорганизмов и проводят посев штрихом в чашке с неселективной средой (например, стриптиказо-соевым агаром).

Инкубируют обе чашки в надлежащих условиях необходимое время, как это установлено в соответ­ствующих стандартах.

Производительность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если по меньшей мере 10 колоний целевых микроорганизмов выросли в чашке с селективным агаром.

Селективность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если не наблюдалось никакого роста (или менее 10 КОЕ) нецелевых микроорганизмов в чашке с неселективным агаром.

Данный метод пригоден для определения рабочих концентраций жидких культуральных сред. Метод является только качественным, и оценки, таким образом, приблизительные. Для испытания мутных сред, напримертетратионатный бульон, этот метод неприменим.

Для эксплуатационных испытаний жидких культуральных сред рабочие культуры непосредственно инокулируют в испытуемую среду, используя петлю на 1 мкл.

Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.

Качественное определение следует проводить визуально путем определения баллов роста, напри­мер от 0 до 2.

Для пробирок и бутылок

• 0 соответствует нулевой мутности;

• 1 соответствует очень слабой мутности;

• 2 соответствует удовлетворительной мутности.

Число баллов для целевых микроорганизмов должно быть равно 2.

Примечания

1. Иногда рост микроорганизмов можно наблюдать только как агрегацию, осаждение клеток на дне пробир­ки или бутылки. В этом случае оценивание и интерпретацию может улучшить тщательное встряхивание.

2. Данный метод позволяет также оценить другие характеристики, такие как образование газа, изменение цвета и т. п.

6. Документирование результатов испытаний

   1. Информация, предоставляемая производителем

Производитель или поставщик культуральных сред должен по запросу предоставлять сведения о ростовых характеристиках микроорганизмов и общую информацию, касающуюся конкретной партии куль­туральной среды.

Все данные обычных эксплуатационных испытаний должны быть зарегистрированы надлежащим образом и храниться в течение достаточного периода времени в соответствии с действующей системой качества. Рекомендуется использование контрольных листов для документирования и оценивания резуль­татов испытаний (см. приложение А).

Приложение А
(реко ме н ду е мое)

Пример таблицы регистрации результатов испытаний
культуральных сред, приготовленных лабораторией пользователя

Таблица А. 1- Пример таблицы

Контрольная таблица для внутренних испытаний на качество культуральных сред

Подробности процесса

Физический контроль качества

Ожидаемое значение pH:

Измеренный
pH:

Качество подтверждено:

Дефекты:

Дата/подпись:

дао,

нет □

Ожидаемое заполняющее ко­личество и/или толщина слоя:

Наблюдается:

Качество подтверждено:

нет □

Дефекты:

Дата/подпись:

Ожидаемый цвет:

Наблюдается:

Качество подтверждено:

Дефекты:

Дата/подпись:

дап,

нет □

Ожидаемая прозрачность /присутствие оптических арте­фактов:

Ожидаемые стабильность/ постоянство/влажность геля:

Наблюдается:

Наблюдается:

Качество подтверждено:

нет □

Качество подтверждено:

нет □

Дефекты:

Дефекты:

Дата/подпись:

Дата/подпись:

Микробное загрязнение

Номера испытуемых чашек или пробирок: Инкубация:

Результат:

Качество подтверждено:

нет □

Номера загряз­ненных чашек или пробирок

Дата/подпись:

Микробиологический рост —

Производительность

Метод контроля:

Количественный □ Качественный □

Штаммы:

Инкубация:

Эталонная среда:

Критерии:

Результат:

Качество под­тверждено: да □, нет □

Дата/подпись:

Микробиологический рост — Селективность

Метод контроля: Количественный □ Качественный □

Штаммы:

Инкубация:

Эталонная среда:

Критерии:

Результат:

Качество под­тверждено: да □, нет □

Дата/подпись:

Микробиологический рост — Специфичность

Метод контроля:

Количественный □ Качественный □

Штаммы:

Инкубация:

Эталонная среда:

Критерии:

Результат:

Качество под­тверждено: да □, нет □

Дата/подпись:

Выпуск партии

П

Подробности хранения

Выпуск партии да □,

нет

Дата/подпись:

Рекомендуемые тест-микроорганизмы для широко используемых
культуральных сред (приводится информация о культуральных средах,
условиях содержания сред, тест-микроорганизмах, номере коллекции культур
тест-микроорганизмов и ожидаемых реакциях)

Таблицы В.1—В.6 составлены, принимая во внимание контрольные штаммы, используемые в Европейской фармакопее, и рекомендации фармакопеи, касающиеся микробиологии пищевых продуктов в отношении культу­ральных сред (Рабочая группа Международного комитета по микробиологии пищевых продуктов и гигиене). Дан­ные критерии предстоит включить в соответствующие стандарты при их подготовке или пересмотре в будущем (новый стандарт или пересмотр). Утвержденная партия среды — это партия среды, которая показала удовлетво­рительные эксплуатационные характеристики. Допускается использование тех же штаммов из других эталонных коллекций (например, NCTC, CIP и др.). Все приводимые среды описаны в стандартах EN и ISO.Таблица B.1 — Селективные среды для подсчета микроорганизмов