Целевые микроорганизмы должны оцениваться в 2 балла и иметь типичный внешний вид, размер и морфологию колоний. Рост нецелевых микроорганизмов должен быть частично или полностью ингибирован (0 или 1).
5.4 Методы, применяемые в отношении жидких культуральных сред
Общие положения
Для определения производительности жидкой среды необходимо использовать подходящий инокулят. Количественный, полуколичественный и качественный методы, описанные ниже, позволяют оценить производительность и селективность. Предлагаемые методы регистрируют степень роста после надлежащей инкубации путем культивирования или штрихового посева из жидких сред на агаровые среды и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) или вычисления баллов для жидкой среды. В случае качественных методов для жидких сред характеристические реакции оценивают визуально.
Количественный метод разбавления для целевых и нецелевых микроорганизмов
Данный метод также пригоден для оценивания новых культуральных сред или разбавителей.
Процедура
Отбирают нужное число пробирок или порций по 10 см3 каждой партии испытуемой жидкой среды.
Инокуляция целевых микроорганизмов: инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон, используя каждый тест-микроорганизм с малым содержанием (например, от 10 до 100 КОЕ в каждой пробирке; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.
Инокуляция нецелевых микроорганизмов: инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон, используя каждый тест-микроорганизм с более высоким содержанием (>1000 КОЕ в каждой пробирке; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.
Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов как смешанной культуры: для испытаний смешанных культур в селективных средах инокулируют испытуемый бульон и эталонный бульон малым количеством целевых микроорганизмов (например, от 10 до 100 КОЕ на каждую пробирку; о приготовлении инокулята см. 5.2.1) и в ту же пробирку вносят значительное количество нецелевых микроорганизмов (> 1000 КОЕ в каждую пробирку; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.
Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов в разбавителях и транспортных средах: инокулируют разбавители тест-микроорганизмами (например, от 100 до 1000 КОЕ в каждую пробирку; о приготовлении инокулята см. 5.2.1), и перемешивают.
Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.
Разбавители должны инкубироваться в течение 45 мин при комнатной температуре и затем быть разлиты по чашкам. Транспортные среды должны инкубироваться при соответствующей температуре и нужное время в соответствии с обычным использованием и затем быть разлиты по чашкам.
Берут аликвотный объем или, при необходимости, разбавление каждого бульона после инкубации и распределяют в чашке с неингибирующим агаром, как это описано в 5.3.1.
Примечание — Для испытаний смешанных культур необходимо проводить распределение, когда это возможно, на чашках с неселективным агаром, которое позволяет достичь дифференциации микроорганизмов в смешанной культуре (например, для подсчета видов Escherichia coll и Salmonella используется агар для чашечного подсчета с MUG). В случае, когда невозможно различить смешанные культуры на неселективном агаре, следует использовать среды с селективным агаром при условии, что были предварительно испытаны их эксплуатационные характеристики.
Снятие результатов, расчеты и интерпретация
После инкубации проводят подсчет колоний целевых и нецелевых микроорганизмов в случае, если в смешанных культурах можно различить разные типы. Расчеты и интерпретацию следует проводить с учетом цели исследования:
^сравнительная интерпретация между эталонным и испытуемым бульонами, используя значения PR и SF, как это описано в 4.2.3.2 и 4.2.3.3:
для целевых микроорганизмов PR не должен быть <0,1 (разница в росте не превышает одного порядка величины);
для нецелевых микроорганизмов SF должен достигать по меньшей мере 2;
в смешанных культурах рост целевых микроорганизмов не должен ингибироваться нецелевыми микроорганизмами, т. е. целевые микроорганизмы должны всегда быть доминирующей популяцией;в других случаях, когда достигается фиксированное минимальное количество целевых микроорганизмов и максимальное количество нецелевых микроорганизмов, более уместно, что:
- содержание целевых микроорганизмов должно достигать от 106 КОЕ/см3 до 108 КОЕ/см3;
-содержание нецелевых микроорганизмов не должно превышать 104 КОЕ/см3 в селективном бульоне;
в случае разбавителей и транспортных сред не требуется ни пониженное, ни повышенное количество целевых и/или нецелевых микроорганизмов. Число микроорганизмов после инкубации в данных средах должно быть в пределах ± 50 % исходного количества.
Примечание — Качество жидкой среды в плане свойств оптимального роста проявляется наиболее обстоятельно на ранней стадии роста. Анализ продолжительности лог-фазы и роста в начале лог-фазы дает наиболее точную информацию относительно производительности и селективности целевых и нецелевых микроорганизмов соответственно в испытуемом и эталонном бульонах. Таким образом, если пытаются обнаружить только минимальные различия в качестве сред, следует провести посев штрихом из жидких сред в чашках после сокращенного периода инкубации продолжительностью, например, 6 или 12 ч.
Полуколичественный метод с одной пробиркой для целевых, нецелевых и смешанных микроорганизмов
Процедура
Отбирают нужное количество пробирок или порций по 10 мл каждой испытуемой партии.
Инокуляция целевых и нецелевых микроорганизмов как смешанной культуры: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона примерно от 10 до 100 КОЕ целевых микроорганизмов и в ту же пробирку инокулируют повышенное число нецелевых микроорганизмов (> 1000 КОЕ на каждую пробирку), и перемешивают.
Инокуляция нецелевых микроорганизмов: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона микроорганизмами с повышенным содержанием (> 1000 КОЕ) и перемешивают.
Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.
Отбирают 10 мкл смешанной культуры и проводят посев штрихом в чашке с конкретной селективной средой для целевых микроорганизмов.
Отбирают одну петлю (10 мкл) культуры нецелевых микроорганизмов и проводят посев штрихом в чашке с неселективной средой (например, стриптиказо-соевым агаром).
Инкубируют обе чашки в надлежащих условиях необходимое время, как это установлено в соответствующих стандартах.
Расчеты и интерпретация результатов
Производительность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если по меньшей мере 10 колоний целевых микроорганизмов выросли в чашке с селективным агаром.
Селективность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если не наблюдалось никакого роста (или менее 10 КОЕ) нецелевых микроорганизмов в чашке с неселективным агаром.
Качественный метод с одной пробиркой
Общие положения
Данный метод пригоден для определения рабочих концентраций жидких культуральных сред. Метод является только качественным, и оценки, таким образом, приблизительные. Для испытания мутных сред, напримертетратионатный бульон, этот метод неприменим.
Процедура
Для эксплуатационных испытаний жидких культуральных сред рабочие культуры непосредственно инокулируют в испытуемую среду, используя петлю на 1 мкл.
Соблюдают время и температуру инкубации, установленные в стандартных методах.
Интерпретация результатов
Качественное определение следует проводить визуально путем определения баллов роста, например от 0 до 2.
Для пробирок и бутылок
0 соответствует нулевой мутности;
1 соответствует очень слабой мутности;
2 соответствует удовлетворительной мутности.
Число баллов для целевых микроорганизмов должно быть равно 2.
Примечания
Иногда рост микроорганизмов можно наблюдать только как агрегацию, осаждение клеток на дне пробирки или бутылки. В этом случае оценивание и интерпретацию может улучшить тщательное встряхивание.
Данный метод позволяет также оценить другие характеристики, такие как образование газа, изменение цвета и т. п.
Документирование результатов испытаний
Информация, предоставляемая производителем
Производитель или поставщик культуральных сред должен по запросу предоставлять сведения о ростовых характеристиках микроорганизмов и общую информацию, касающуюся конкретной партии культуральной среды.
Прослеживаемость
Все данные обычных эксплуатационных испытаний должны быть зарегистрированы надлежащим образом и храниться в течение достаточного периода времени в соответствии с действующей системой качества. Рекомендуется использование контрольных листов для документирования и оценивания результатов испытаний (см. приложение А).
Приложение А
(реко ме н ду е мое)
Пример таблицы регистрации результатов испытаний
культуральных сред, приготовленных лабораторией пользователя
Таблица А. 1- Пример таблицы
Контрольная таблица для внутренних испытаний на качество культуральных сред
Культуральная среда: |
Приготовленный объем: |
Дата добавления: |
Внутренний номер партии: |
|
Обезвоженная среда (и код): |
Поставщик: |
Партия |
Количество: |
Дата/подпись: |
Добавка: |
Поставщик: |
Партия |
Количество: |
Дата/подпись: |
Подробности процесса
Физический контроль качества
Ожидаемое значение pH:
Измеренный
pH:
Качество подтверждено:
Дефекты:
Дата/подпись:
дао,
нет □
Ожидаемое заполняющее количество и/или толщина слоя:
Наблюдается:
Качество подтверждено:
нет □
Дефекты:
Дата/подпись:
Ожидаемый цвет:
Наблюдается:
Качество подтверждено:
Дефекты:
Дата/подпись:
дап,
нет □
Ожидаемая прозрачность /присутствие оптических артефактов:
Ожидаемые стабильность/ постоянство/влажность геля:
Наблюдается:
Наблюдается:
Качество подтверждено:
нет □
Качество подтверждено:
нет □
Дефекты:
Дефекты:
Дата/подпись:
Дата/подпись:
Микробное загрязнение
Номера испытуемых чашек или пробирок: Инкубация:
Результат:
Качество подтверждено:
нет □
Номера загрязненных чашек или пробирок
Дата/подпись:
Микробиологический рост —
Производительность
Метод контроля:
Количественный □ Качественный □
Штаммы:
Инкубация:
Эталонная среда:
Критерии:
Результат:
Качество подтверждено: да □, нет □
Дата/подпись:
Микробиологический рост — Селективность
Метод контроля: Количественный □ Качественный □
Штаммы:
Инкубация:
Эталонная среда:
Критерии:
Результат:
Качество подтверждено: да □, нет □
Дата/подпись:
Микробиологический рост — Специфичность
Метод контроля:
Количественный □ Качественный □
Штаммы:
Инкубация:
Эталонная среда:
Критерии:
Результат:
Качество подтверждено: да □, нет □
Дата/подпись:
Выпуск партии
П
Подробности хранения
Выпуск партии да □,
нет
Дата/подпись:
Рекомендуемые тест-микроорганизмы для широко используемых
культуральных сред (приводится информация о культуральных средах,
условиях содержания сред, тест-микроорганизмах, номере коллекции культур
тест-микроорганизмов и ожидаемых реакциях)
Таблицы В.1—В.6 составлены, принимая во внимание контрольные штаммы, используемые в Европейской фармакопее, и рекомендации фармакопеи, касающиеся микробиологии пищевых продуктов в отношении культуральных сред (Рабочая группа Международного комитета по микробиологии пищевых продуктов и гигиене). Данные критерии предстоит включить в соответствующие стандарты при их подготовке или пересмотре в будущем (новый стандарт или пересмотр). Утвержденная партия среды — это партия среды, которая показала удовлетворительные эксплуатационные характеристики. Допускается использование тех же штаммов из других эталонных коллекций (например, NCTC, CIP и др.). Все приводимые среды описаны в стандартах EN и ISO.Таблица B.1 — Селективные среды для подсчета микроорганизмов