- результати вивчення імунітету проти дифтерії, правця та кору по кожній області по вікових групах надають у відповідні методичні центри.
Відбір контингентів для обстеження може проводитися також методом гніздової вибірки (кластерний метод).
Цей метод заснований на обстеженні кластерів, тобто груп населення, відібраних шляхом випадкової вибірки. Для цілей Розширеною програмою імунізації ВООЗ (РПІ) теоретично і практично обґрунтована формула мінімальної вибірки: 30 x 7 (30 кластерів по 7 дітей у кожнім). При цієї кількості обстежених (210) вірогідність отриманої оцінки складає 95%. Слід зазначити, що усі відібрані кластери повинні бути обстежені протягом обмеженого періоду часу (переважно протягом 1 міс.), що забезпечує велику репрезентативність зібраних даних.
Метод гніздової вибірки містить у собі наступні етапи: вибір категорії населення, що підлягає обстеженню; вибір території для обстеження: визначення місцезнаходження кластерів на обраній території і типу об'єктів у середині кластера, у яких буде проводиться збір інформації (родина, двір, школа і т.п.); збір даних; обробка й аналіз зібраних у кластері даних; оцінка отриманих результатів.
Після визначення території, на якій планується провести обстеження, спочатку необхідне визначити кластери і скласти список. Вибір кластерів з наявного списку може бути здійснений різними шляхами, але при цьому повинна бути відома чи по крайньої мер піддаватися оцінці імовірність включення кожної одиниці вибору в число обстежуваних кластерів. Найбільш простим варіантом є рівноімовірний вибір, що дає кожній одиниці рівний шанс потрапити в групу кластерів.
4.2. Техніка забору матеріалу для оцінки імунітету та підготовка його для дослідження
4.2.1. Забір матеріалу для імунологічного моніторингу. Для імунологічного моніторингу широко використовуються різні методи виявлення в сироватці крові специфічних антитіл до збудників інфекцій. Незважаючи на те, що ці методи не є досконалими, так як наявність тільки антитіл не відображує повністю стан макроорганізму, але серологічні методи конче потрібні для вирішення цілого ряду питань, що стосуються епідеміології тієї чи іншої інфекції.
Забір крові з пальця здійснюють співробітники лікувально-профілактичних закладів. Кров відбирають в гумових рукавичках, дотримуючись правил асептики, оброблюючи рукавички 70% спиртом перед кожним взяттям. Шкіру пальця обробляють стерильним ватним тампоном, змоченим 70% спиртом, проколюють стерильним скарифікатором одноразового використання.
Проби крові беруть з кінцевої фаланги безіменного пальця лівої руки. Індивідуальним стерильним скарифікатором одноразового використання роблять один або два проколи шкіри на відстані 1,5- в м'якуш пальця в напрямку, перпендикулярному дактилоскопічним лініям пальця. Кров збирають в стерильні капіляри Панченкова та грушею видувають в стерильні центрифужні пробірки, які нумерують. Об'єм крові повинен становити 0,8-1,0 мл. При обстеженні дітей першого року життя, а також у випадках, коли не вдається взяти кров в належній кількості, її беруть в об'ємі 0,2 мл або 0,5 мл у центрифужну пробірку з 1,8 мл фізіологічного розчину. У такому разі початкове розведення сироватки становить 1:20-1:10.
Після взяття крові до місця проколу шкіри прикладають ватний тампон з 70% спиртом. Пробірку закривають ватою і залишають під кутом 10-15 град. на 10-15 хвилин для утворення згустку крові. Після цього пробірки ставлять у штатив і в той же день доставляють в лабораторію. В супроводжуючому документі вказують прізвище, ім'я, вік, установу (N дитячого закладу, групу, школу, клас), дату забору крові, щеплювальний анамнез.
В лабораторії центрифужні пробірки з кров'ю обводять запаяною пастерівською піпеткою або петлею та ставлять у холодильник на 18-24 години. Через добу обережно відокремлюють сироватку від згустку пастерівською піпеткою за допомогою гумової груші (сироватка повинна бути прозорою, без ознак гемолізу). Потім сироватку відсмоктують в одноразову стерильну пластикову пробірку (епіндорф) або стерильні ампули з обов'язковим переносом на них етикеток з попередніх пробірок і в термоконтейнері з супроводжуючими списками в двох екземплярах, які в целофанових пакетах закріплюють під кришкою термоконтейнеру, направляють на дослідження у відповідну лабораторію. Далі їх використовують у серологічних реакціях.
Ампульовану сироватку зберігають у холодильнику при температурі + град. С не більш одного тижня, при необхідності більш тривалого збереження - у морозильній камері. При температурі -15 град. С сироватки можна зберігати до 1 року, але не допускається багаторазове заморожування та розморожування сироватки, для цього сироватку розливають в декілька епіндорфів або стерильних ампул по 0,25 мл, а потім вже заморожують.
Одержані сироватки, зібрані у різні строки, досліджують одночасно.
4.2.2. Забір матеріалу для діагностики кору. Згідно рекомендацій ВООЗ, для одержання коректних результатів і їх інтерпретації, велике значення має правильно вибраний час відбору зразка крові відносно появи клінічних симптомів. Кров у хворого відбирають в проміжку між 4 та 28 днями від моменту появи висипки:
- Стерильним шприцом відбирають 5,0 мл венозної крові пацієнта в стерильну пробірку з етикеткою, на якій зазначена інформація про хворого та дата відбору крові.
- Цільну кров центрифугують при (3000 об/хв.) протягом 10 хв. для одержання сироватки.
- За відсутності центрифуги, кров залишають на 24 год. в холодильнику при (+4 град. С)-(+8 град. С) для ретракції згустку, а потім обережно переносять сироватку в другу стерильну пробірку для транспортування з інформацією про хворого (епідномер, ПІБ, дата відбору).
- Стерильну сироватку зберігають до проведення дослідження в холодильнику при (+4 град. С)-(+8 град. С), але не більше 7 діб.
- Для тривалого зберігання сироватку заморожують при -20 град. С і транспортують в лабораторію в замороженому стані. Повторне заморожування та відтаювання сироватки не доцільне, так як при цьому руйнуються специфічні антитіла.
- В направленні на лабораторне дослідження обов'язково вказують: епідномер, дату останньої вакцинації проти кору, дату появи висипу та дату відбору зразка.
5. Методи вивчення та оцінки імунітету
5.1. Оцінка протидифтерійного імунітету
Вивчення специфічного імунітету проводиться за даними реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) та імуноферментного аналізу (ІФА). Ці методи є найбільш простими, дешевими та дозволяють досить швидко одержати результати досліджень.
Крім того, цілий ряд досліджень свідчить про значну кореляцію метода ІФА з методом нейтралізації антитіл сироваток в культурі клітин Vero при вивченні рівня антитоксичного імунітету, що підтверджує адекватність цих методів. Але "золотим" стандартом визначення кількості антитіл в сироватці крові все ж є реакція нейтралізації на морських свинках та кролях, яка дозволяє порівняти кількість антитіл в досліджуваній сироватці зі стандартною дозою протидифтерійних антитіл, яка нейтралізує еритрогенний ефект (гіперемію та запалення в ділянці введення) стандартної дози дифтерійного токсину. Цей метод дуже трудомісткий, складний та дорогий. Тому він використовується лише як національний та міжнародний стандарт.
5.1.1. Реакція пасивної гемаглютинації. Для визначення рівня дифтерійного антитоксину в сироватках людини використовують тільки сертифіковані діагностикуми. Перед використанням кожної нової серії ерітроцитарного діагностикума необхідно провести перевірку активності препарату, яка вказана на пробірці антигену. Діагностикум, який виявляє в сироватці антитіла в концентрації на 3 розведення нижче вказаного на етикетці стандартної сироватки, не придатний для використання.
Методика дослідження сироваток та облік результатів РПГА викладені в інструкції щодо використання еритроцитарного дифтерійного антигенного діагностикума.
Стан вакцинального імунітету оцінюється за титрами антитіл або по вмісту антитоксичних антитіл в МО/мл. Для перерахування титрів антитоксинів в МО/мл проводять титрацію стандартної протидифтерійної сироватки, титр якої визначений в міжнародних одиницях (МО/мл). Це дає змогу додержуватися єдиних, рекомендованих ВООЗ, кількісних критеріїв, які характеризують ступень сприйнятливості людей до дифтерії, якими користуються в усьому світі (таб.). Однак, слід враховувати, що результати перерахунку є орієнтовними.
Таблиця
Критерії сприйнятливості до дифтерії, що рекомендовані ВООЗ (Efstratiou, Maple - 1994)
|
Вміст (рівень)антитоксичнихантитіл |
Інтерпретація результатів |
|
< 0,01 МО/мл |
Людина сприйнятлива до дифтерії |
|
0,01 МО/мл |
Мінімальний рівень циркулюючих антитіл, щозабезпечує деякий ступень захисту |
|
0,01-0,09 МО/мл |
Рівень циркулюючих антитоксичних антитіл, щозабезпечує певну ступень захисту |
|
0,1 МО/мл |
Захисний рівень циркулюючих антитіл |
|
>= 1,0 МО/мл |
Рівень антитоксичних антитіл, що забезпечуєстійку, тривалу несприйнятливість додифтерії |
5.1.2. Імуноферментний аналіз. В зв'язку з тим, що при постановці РПГА інколи спостерігаються псевдонегативні результати, які обумовлені низьким рівнем протидифтерійних антитіл (< 0,01 МО/мл), доцільним є використання ІФА з набором реагентів антибактеріальних та антитоксичних імуноглобулінів A, M, G людини.
В основу ІФА покладено принцип утворення специфічного комплексу антиген-антитіло, який виявляється за допомогою іншого антитіла, міченого пероксидазою хрону. Після додання субстратної суміші розвивається ферментативна реакція, яка виявляється по наявності кольору та реєструється за допомогою імуноферментного аналізатора при довжині хвилі 492 нм. Проведення досліджень здійснюється згідно інструкції, що додається до тест-систем.
5.2. Оцінка протиправцевого імунітету
Для вивчення рівня протиправцевого імунітету використовують різні методи як in vivo, так і in vitro. Найбільш чутливим та точним методом є реакція нейтралізації стандартного правцевого токсину антитілами, які містяться в досліджуваних сироватках імунізованих людей та виявляються в організмі лабораторних тварин (мишей). За допомогою цієї реакції визначаються в основному сироваточні антитіла класу IgG, які виявляються навіть у титрах 0,001 МО/мл.
Однак, цей метод є досить дорогим, так як потребує значних затрат часу, наявності певної кількості лабораторних тварин, кваліфікованих фахівців та більш великого об'єму досліджуваної сироватки, тому він малопридатний для практичних робітників охорони здоров'я. Взаємодію між правцевим анатоксином та протиправцевими антитілами найбільш просто можна визначити in vitro за допомогою реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та імуноферментного (ІФА) аналізу.
Ці методи достатньо чутливі, дають змогу швидко одержати результати і мають невелику вартість. Між тим, вони менш специфічні, ніж реакція нейтралізації in vivo, але більш чутливі при виявленні IgM, ніж при дослідженні IgG, особливо на ранній стадії первинної імунної відповіді.
5.2.1. Реакція непрямої гемаглютинації. Ця реакція все ще використовується в Україні для оцінки стану протиправцевого імунітету. Методика дослідження сироваток та облік реакції докладно наведені в інструкції щодо використання діагностикума.
Основним недоліком РНГА є те, що чутливість її пов'язана з наявністю переважно IgM-антитіл. Незважаючи на те, що відмічається висока кореляція між результатами РНГА та РН, при дослідженні цими двома методами окремих сироваток інколи може відмічатися дуже суттєва різниця. Особливо виражені такі відмінності при тестуванні сироваток з низьким вмістом протиправцевих антитіл.
5.2.2. Імуноферментний аналіз. Метод непрямого варіанту ІФА, рекомендований ВООЗ як найбільш інформативний, базується на тому, що специфічні антитіла, які містяться у досліджуваному матеріалі реагують з правцевим анатоксином, котрий був попередньо адсорбований на поверхні планшету, і утворюють комплекс "антиген-антитіло". Цей комплекс у подальшому виступає як антиген. Потім до утвореного комплексу "антиген-антитіло" додають кон'югат, який являє собою імуноглобуліни людини, мічені ферментом пероксідазою хрону, котрий вступає в реакцію як антитіло. Після завершення цієї реакції відмивають лишки кон'югату, а кон'югат, що зв'язався, виявляють за допомогою субстрату (розчину-хромогену). Кількість зв'язаного кон'югата пропорційна концентрації антитіл в досліджуваній сироватці, і вимірюється за допомогою визначення інтенсивності руйнування ферментом відповідного субстрату. Як правило, субстрат підбирають таким чином, щоб в результаті його взаємодії з ферментом змінювався колір рідини. Інтенсивність кольору рідини визначають за допомогою спектрофотометра.
Ефективність вакцин, що містять правцевий анатоксин коливається в межах 80%-100%. В експериментах на тваринах, в яких визначали кореляцію титрів антитіл з проявами симптомів правця або гибель тварин, було встановлено, що мінімальним "захисним" рівнем антитіл є концентрація 0,01 МО/мл сироватки крові. Між тим, як вказано в рекомендаціях ВООЗ, застосовувати термін "захисний рівень антитіл" інколи невірно, тому що титр антитіл, визначений в РНГА, який відповідає 0,01 МО/мл в ІФА, не є еквівалентним титру антитіл, що визначається in vivo в реакції нейтралізації, і тому є завищеним. Це особливо необхідно враховувати при оцінці протиправцевого імунітету у хворих з різними пораненнями або при визначенні природного імунітету у людей. При оцінці специфічного імунітету за допомогою РНГА та ІФА захисним титром вважають титр 0,1 МО/мл, а мінімальним "захисним" титром 0,01 МО/мл.
5.3. Оцінка протикашлюкового імунітету
Для визначення антибактеріальних антитіл проти кашлюку використовують в основному тести in vitro - реакцію аглютинації (РА) та ІФА, а для визначення антитоксичного імунітету - реакцію нейтралізації (РН) на культурі оваріальних клітин китайського ховрашка (ССНО).
