Якщо кількість підозрілих колоній значна, то можна поставити пробу Закса для визначення наявності ферменту уреази;
6) на підставі вивчення характеру колоній і морфології клітин у мазках, пофарбованих за Грамом, позитивної реакції аглютинації з видовими неадсорбованими сироватками до факторів 1 і 14, на третю добу можна видати попередню відповідь;
7) при відсутності росту підозрілих колоній на середовищі, чашки Петрі знову поміщають у термостат на 24-48 годин і переглядають повторно у відповідний термін.
6.4. П’ятий-шостий день дослідження (4-5 доба, 96-120 годин):
1) переглядають посіви, зроблені для виділення чистої культури, і відзначають зміну кольору середовища: В.parapertussis дифузно забарвлюють середовище вирощування (КВА) у бурувато-коричневий колір;
2) на предметному склі в краплі фізіологічного розчину готують мазок і забарвлюють його за Грамом, визначаючи морфологію виділеної культури, її чистоту, а також відсутність спонтанної аглютинації;
3) серологічні властивості перевіряють у реакції аглютинації на склі зі специфічними неадсорбованими сироватками до В. pertussis і В. parapertussis, розведеними 1:10, а також з адсорбованими монорецепторними сироватками до факторів 1 і 14. Серовар В. pertussis визначають аглютинацією з монорецепторними сироватками до факторів 1,2,3;
4) для перевірки біохімічних властивостей роблять посіви чистої культури на агарове середовище з тирозином (визначення наявності тирозинази), виявляють наявність уреази за методом Закса або посівом на бульйон Хоттінгера. При підозрі на виділення чистої культури В.bronchiseptica, визначають утилізацію цитрату на середовищі Сімонса і рухливість шляхом посіву у напіврідкий агар (0,3% агар-агару).
В.pertussis біохімічно інертна: не росте на м’ясопептонному агарі, не змінює колір агарового середовища з тирозином, не має ферменту уреази (проба Заксе - негативна), не утилізує цитрат.
В.parapertussis дає ріст на простих поживних середовищах, змінює колір середовища з тирозином на коричневий, має фермент уреазу (проба Заксе позитивна).
В.bronchiseptica відрізняється швидким ростом на простих поживних середовищах, рухливістю, не змінює кольору середовища з тирозином, здатна утилізувати цитрат на середовищі Сімонса (Додаток №1);
5) на підставі вивчення чистої культури: морфології колоній і клітин, реакції аглютинації з видовими неадсорбованими сироватками й адсорбованими монорецепторними сироватками до факторів 1 і 14, результатів проби на уреазу, зміни кольору середовища з тирозином, утилізації цитратів може бути видана остаточна позитивна відповідь;
6) якщо протягом п’яти діб (6 день дослідження) на середовищі вирощування не виявлені колонії, підозрілі для бактерій роду Bordetella, дослідження припиняють і видають остаточну негативну відповідь.
7. Вивчення ферментативної активності
7.1.Виявлення уреазної активності.
Метод базується на здатності мікроорганізмів, які мають фермент уреазу, розщеплювати сечовину до аміаку, за рахунок якого відбуваються зміна рН середовища, що виявляють за зміною кольору індикатора.
Суміш реактивів А (1 частина) і Б (19 частин) розливають по 0,1 - 0,2 см3 у стерильні аглютинаційні пробірки (із пробками) і вносять 1-2 петлі досліджуваної культури. Одночасно ставлять контроль реактиву без внесення культури. Пробірки поміщають у термостат при 35-37°С на 30 хв. Облік результатів проводять після інкубування, а при відсутності зміни кольору суміші - пробірки залишають при кімнатній температурі і результат враховують наступного дня. При наявності у мікроорганізму ферменту уреази відбувається розщеплення сечовини до аміаку, що приводить до залуження середовища, зміни його кольору з жовтого в малиновий.
7.2.Визначення здатності утилізувати цитрат як єдине джерело вуглецю.
Досліджувану культуру засівають на скошене середовище Сімонса і інкубують при (37±1)°С одну добу. Цитрат-асимілюючі бактерії добре ростуть, залужують середовище і викликають забарвлення його в синій колір. Мікроби, що не асимілюють цитрати, на цьому середовищі не ростуть і не змінюють його кольору.
7.3.Визначення пігментоутворення.
Засівають культуру, що виділена на простий поживний агар з 0,1% тирозином і інкубують протягом доби при (37±1)°С. При розщепленні тирозину середовище забарвлюється в жовто-коричневий колір.
8. Дослідження атипових штамів бордетел
8.1. У вогнищах кашлюкової інфекції можуть бути виявлені атипові штами збудника кашлюку. Вони відрізняються від типових культур морфологічними властивостями і характером колоній. На середовищі вирощування (КВА) такі штами утворять через 72 години росту іноді більш великі колонії з плоскою поверхнею, з центром, що западає, іноді не мають світлового конусу, білуватого, бурого, жовтуватого або ледь рожевого чи зеленуватого кольору, мають маслянисту консистенцію. При відборі таких колоній на вторинні чашки, вони можуть давати зливний ріст слизистого характеру з зеленувато-жовтим пігментом. Частина таких штамів виділяється уповільненим ростом і зниженою життєздатністю: мікроби виростають на первинних чашках через 6-7 і більше діб, а при наступних відсівах таких колоній вони іноді не виростають.
Морфологія клітин у мазках з колоній може відрізнятися від типової: зустрічаються більш довгі палички, роздуті овоїдні палички, форми у вигляді стрептобацил. Чиста культура, виділена з таких колоній, має типові для кашлюкового мікроба властивості. Біохімічні і серологічні властивості атипових штамів характерні для кашлюкового мікроба: вони не розкладають сечовину і тирозин, позитивні в реакції аглютинації на склі зі специфічними видовими неадсорбованими сироватками, типується моноспецифічними рецепторними сироватками до факторів 1,2,3.
8.2. У ряді випадків із ротоглотки дітей і дорослих можуть бути виділені грамнегативні бактерії подібні до кашлюкового мікроба за морфологією, видом колоній і серологічними властивостями. У чистій культурі вони являють собою грамнегативні овоїдні палички, утворюють подібні з типовими кашлюковими мікробами колонії, аглютинують на склі з видовими неадсорбованими кашлюковими і паракашлюковими сироватками, дають позитивну реакцію аглютинації в пробірках у розведеннях до 1:320 і не аглютинують з монорецепторними сироватками. Спеціальні дослідження в реакції імуноелектрофорезу показали, що вони не мають антигенів, характерних для кашлюкового і паракашлюкового мікробів, і добре ростуть на простих поживних середовищах.
Враховуючи наявність атипових штамів бордетел, рекомендується при виділенні чистої культури відсівати з поживного середовища максимальну кількість колоній усіх видів, у середньому не менше п’яти.
9. Терміни видачі і формулювання відповідей
9.1. Відповідь при дослідженні на кашлюк та паракашлюк видається, як правило, на 3-5 добу.
Попередня позитивна відповідь може бути видана на третю добу з формулюванням: “Виявлені мікроби, підозрілі на бактерії роду Bordetella, дослідження продовжується”.
Остаточна позитивна відповідь може бути видана на 5-6 добу і формулюється так: “Виявлені В. pertussis (В. parapertussis, B.bronchiseptica)”.
Негативна відповідь видається на 5 добу при відсутності підозрілих колоній на бактерії роду Bordetella і формулюється так: “Бактерії роду Bordetella не виявлені”.
9.2. У випадку уповільненого росту мікробів або виділення нетипової культури попередня й остаточна відповіді можуть бути видані пізніше (6-7 доба).
10. Серологічна діагностика
10.1. Серологічна діагностика кашлюку та паракашлюку полягає у виявленні в досліджуваній сироватці специфічних антитіл. З цією метою використовують РА, РНГА, ІФА. Дослідження проводять на 2-3 тижні захворювання, коли в крові хворих з’являються специфічні антитіла. У зв’язку із широкою імунізацією проти кашлюку результати серологічних реакцій можуть мати діагностичне значення тільки при вивченні їх у динаміці, досліджуючи парні сироватки хворого не менше, ніж 2-3 рази з інтервалом 1-2 тижні. Серологічні реакції слід ставити паралельно з кашлюковим і паракашлюковим діагностикумами.
10.2. Кров для дослідження можна взяти з пальця (0,8-1,0 см3) з дотриманням звичайних правил асептики. Кров збирають, приклавши до місця уколу відтягнутий (не занадто тонко) кінець короткої пастерівської піпетки. Кров з піпетки видувають у центрифужну пробірку, яку потім поміщають на 10-15 хв. у термостат. Згусток, що утворився, відокремлюють від стінки пробірки і поміщають в холодильник до відділення сироватки. Сироватку відсмоктують пастерівською піпеткою, розводять фізіологічним розчином 1:5 або 1:10, щільно закривають пробкою і зберігають у холодильнику.
10.3. Коли вдається взяти кров у невеликій кількості, її набирають у кількості 0,2 або 0,5 см3 і вносять у пробірку, куди попередньо наливають 1,8 см3 стерильного фізіологічного розчину. Після центрифугування суміш сироватки з фізіологічним розчином (розведення сироватки відповідно 1:20 або 1:10) переносять у стерильну пробірку і з неї роблять наступні 2-кратні розведення (1:20, 1:40 і т.д.).
Класичним методом серологічної діагностики кашлюка, найбільш доступний в умовах практичної лабораторії є реакція аглютинації, яка дозволяє виявити антитіла індуковані аглютиногенами збудника.
10.4. Реакція аглютинації
Із досліджуваної сироватки готують 9-10 послідовних розведень: 1:5, 1:10 і т.п. до 1:1280 або 1:2560. Обов’язково ставлять контролі діагностикуму, сироватки та фізрозчину. Реакцію аглютинації ставлять у такий спосіб: до 0,25 см3 відповідного розведення сироватки додають 0,25 см3 діагностикуму. Пробірки поміщають у термостат при (37±1)°С на 2 години, а потім залишають при кімнатній температурі (20±2)°С. Результати враховують наступного дня за допомогою аглютиноскопа. В першу чергу проводять оцінку контролів. Діагностикум з розчином натрію хлористого (КД) повинний мати рівномірну каламуть без пластівців. Сироватка з розчином натрію хлористого (КС) та розчин натрію хлористого (КФЗР) повинні бути прозорими. Якщо контролі відповідають вимогам, враховують результати реакції аглютинації.
Кінцевим титром вважають розведення, при якому відзначається чітка аглютинація на два хрести (++), однак реакція враховується як позитивна лише при наявності в попередніх пробірках чіткої аглютинації на чотири або три хрести (++++ або +++).
Сироватка + фіз.р-н 1:5 або 1:10 зберігають у холодильнику
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
|
|
1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 КД КС КФЗР
|
0,25см3 відповідного розведення 0,25см3 діагностикуму |
на 2 год. при 37°С, потім при кімнатній температурі до наступного дня |
аглютиноскоп діагностичний титр (++), якщо попередні (+++).
Діагностичним титром реакції аглютинації у не щеплених і тих, що не хворіли дітей вважають розведення 1:80.
У імунізованих дітей і дорослих позитивні результати реакції враховують тільки при дослідженні парних сироваток крові, узятих з інтервалом 1-2 тижні при наростанні титру не менше, ніж у 4 рази.
11. Перспективні методи лабораторної діагностики*
Перспективним є впровадження сучасних експрес-методів:
1) імунофлюоресцентний - визначення антигенів збудника в слизі задньої стінки глотки;
2) латексна мікроаглютинація - визначення антигенів кашлюкової палички в слизі задньої стінки глотки.
3) імуноферментний аналіз (ІФА), за допомогою якого визначають антитіла класів імуноглобулінів М (ІgМ) і G(ІgG) у різні терміни захворювання. За допомогою методу ІФА можна визначати також антигени В. pertussis у слизі ротоглотки.
________________________________________________
*Застосовуються при наявності відповідних імунобіологічних препаратів
4) ПЛР – діагностика, в ході якої виявляють наявність ДНК кашлюкового мікроба у мокроті.
12.Форми первинної облікової звітності
Реєстрація матеріалу, що надходить на дослідження, відображається у журналі за ф.252/0 “Журнал реєстрації мікробіологічних і паразитологічних досліджень”, хід аналізу, результати досліджень повинні бути відображені в журналі за ф. 253/0 „Робочий журнал мікробіологічних досліджень”. Реєстрацію матеріалу і результатів серологічних досліджень проводять в журналі за ф.259/0 “Журнал реєстрації серологічних досліджень”.
13. Збереження культур бордетел
13.1. Способи тривалого збереження (без пересівання)
культур бордетел
Для збереження культур бордетел готують наступні консервуючи суміші:
1) 80% розчин гліцерину в буферному фізіологічному розчині, простерилізованому в автоклаві при 1,3 атм. протягом 30 хвилин.
Буферний фізіологічний розчин готують, розчиняючи в 8дм3 дистильованої води NaCI - , Na2HPO4 - , КН2P04 - і автоклавують при 0,5 атм. протягом 30 хв. Розчин повинен мати рН - 7,2.
2) сахарозо-желатинове середовище (10% розчин сахарози і 1% розчин желатини).
Для приготування сахарозо-желатинового середовища попередньо готують 2 розчини: на водяній бані при температурі +55°С необхідно розчинити в 300см3 дистильованої води желатини (1 розчин) і в 300 см3 дистильованої води - сахарози (2 розчин). Потім обидва розчини з’єднують, доповнюють до 1дм3 дистильованою водою; встановлюють рН 7,0 розчином бікарбонату натрію і розливають у флакони. Флакони з готовим розчином стерилізують текучою парою в автоклаві 3 дні по 1 годині.
У стерильних аглютинаційних пробірках змішують по 2 см3 стерильного 80% розчину гліцерину в буферному фізіологічному розчині і сахарозо-желатинового середовища, поміщають на дно пробірки 3-4 петлі 3-х добової культури кашлюкового мікроба, закривають ватно-марлевою пробкою і зберігають у морозильній камері при температурі -30°С до 1 року. При висівах беруть петлею частину матеріалу з дна пробірки і висівають на середовище КВА з 3-4% крові, розтираючи шпателем.
13. 2. Збереження культур бордетел
в напіврідкому КВА (із кров'ю і без крові)
